ПРИКАЗ МИНЗДРАВА РФ ОТ 26.03.2001 n 87″О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА»(ВМЕСТЕ С МЕТОДИЧЕСКИМИ УКАЗАНИЯМИ «ПОСТАНОВКА ОТБОРОЧНЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТОВ НА СИФИЛИС», «РАСЧЕТНЫЕ НОРМЫ ВРЕМЕНИ ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ СИФИЛИСА МЕТОДОМ РЕАКЦИИ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ»)
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРИКАЗ
26 марта 2001 г.
N 87
О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА
Эпидемиологическая ситуация с заболеваемостью сифилисом остается крайне напряженной. С начала 90-х годов она возросла почти в 40 раз и в 1999 г. достигла 186,7 случаев на 100 тыс. населения.
Серьезность ситуации усугубляется тем, что сифилис, как и другие инфекции, передаваемые половым путем, способствует распространению ВИЧ-инфекции.
Одним из основных мероприятий, направленных на предупреждение дальнейшего распространения заболеваемости сифилисом, является его ранняя диагностика.
Однако материально — техническая база серологических лабораторий не соответствует потребностям учреждений здравоохранения. За последние десять лет число кожно — венерологических диспансеров, не имеющих в своем составе серологических лабораторий, возросло с 25,3% в 1989 г. до 31,2% в 1999 г.
С целью совершенствования лабораторной диагностики сифилиса, повышения качества работы и обеспечения единства подхода по ее организации:
ПРИКАЗЫВАЮ:
1. Утвердить:
1.1. Методические указания «Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис» (приложение N 1).
1.2. Методические указания «Расчетные нормы времени проведения лабораторных исследований при диагностике сифилиса методом реакции пассивной гемагглютинации» (приложение N 2)
2. Директору Центрального научно — исследовательского кожно — венерологического института Минздрава России А.А.Кубановой, директору Уральского научно — исследовательского института дермато — венерологии и иммунопатологии Минздрава России Н.В.Кунгурову, директору Нижегородского научно — исследовательского кожно — венерологического института Минздрава России Н.К.Никулину:
2.1. Обеспечить организационно — методическое руководство по внедрению диагностических тестов в субъектах Российской Федерации в соответствии с приложениями N 1 и N 2.
2.2. До 01.06.2001 подготовить и представить в установленном порядке необходимые материалы на аккредитацию серологических лабораторий научно — исследовательских институтов в качестве экспертных в здравоохранении.
2.3. Обеспечить проведение внешнего контроля качества лабораторной диагностики сифилиса.
3. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов Российской Федерации:
3.1. Организовать работу по серологической диагностике сифилиса в соответствии с приложениями N 1, N 2.
3.2. Принять неотложные меры по развитию и укреплению материально — технической базы серологических лабораторий, обратив особое внимание на организацию таких лабораторий в составе кожно — венерологических диспансеров.
4. Считать не действующим на территории Российской Федерации приказ Министерства здравоохранения СССР от 2 сентября 1985 г. N 1161 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса».
5. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на Первого заместителя Министра А.И.Вялкова.
Министр
Ю.Л.ШЕВЧЕНКО
Приложение N 1
Утверждено приказом
Минздрава России
от 26.03.2001 г. N 87
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПОСТАНОВКА ОТБОРОЧНЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ
ТЕСТОВ НА СИФИЛИС
Аннотация
Методические указания предназначены для лабораторных работников и клиницистов дерматовенерологической службы России. Указания посвящены современным методам серо- и ликвородиагностики сифилиса, широко апробированным в научно — исследовательских и лечебно — профилактических учреждениях страны. Представлены новые высоко чувствительные специфичные методики постановки реакций на сифилис. Освещено предназначение различных тестов в качестве отборочных, диагностических и контрольных для оценки эффективности лечения. Описаны принципы реакций, методики их постановки, материально — техническое обеспечение, источники получения ошибочных результатов и мероприятия по технике безопасности при работе с инфекционным материалом.
Организация — разработчик: ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ.
Авторы: докт. биол. наук, проф. Г.А.Дмитриев, докт. мед. наук, проф. В.Н.Беднова, докт. мед. наук Г.Ф.Тимченко, канд. мед. наук Г.А.Киселева, канд. мед. наук Т.И.Милонова, канд. мед. наук О.А.Стоянова, З.П.Акопова.
Введение
Для серо- и ликвородиагностики сифилиса в России могут применяться следующие методы:
1. Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР), которая является отборочным тестом при обследовании населения на сифилис. Постановка МР осуществляется с плазмой или инактивированной сывороткой крови. Зарубежные тесты ВДРЛ (VDRL), РПР (RPR) и другие аналогичные МР как по принципу постановки реакции, так и по чувствительности и специфичности.
2. Иммуноферментный анализ (ИФА). Антиген из культуральных или патогенных бледных трепонем.
3. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Антиген из культуральных или патогенных бледных трепонем.
4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ-абс, РИФ-ц, РИФ с капиллярной кровью из пальца. Антиген — патогенная бледная трепонема штамма Никольса.
5. Комплекс серологических реакций на сифилис (КСР), состоящий из реакции связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами, и МР. Поскольку трепонемный антиген является специфическим, КСР относится к диагностическим тестам. В связи с разработкой более чувствительных, специфичных и менее трудоемких реакций стало возможным заменить при постановке КСР реакцию связывания комплемента на ИФА или РПГА также в сочетании с МР.
6. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), в которой в качестве антигена используют патогенные бледные трепонемы штамма Никольса.
РИТ, РИФ, ИФА и РПГА являются высокочувствительными и высокоспецифичными реакциями на сифилис. Они относятся к диагностическим подтверждающим тестам. При этом в связи с простотой постановки и наличием коммерческих тест — систем ИФА и РПГА могут быть и высокоэффективными отборочными тестами.
Ввиду различной чувствительности при разных формах сифилиса, специфичности и сложности постановки каждая из указанных реакций имеет свое предназначение.
Профилактическое обследование населения на сифилис можно проводить с помощью МР, КСР, ИФА и РПГА. Все организационные вопросы по применению данных реакций с этой целью решаются органами здравоохранения на местах в зависимости от местных условий и возможностей.
При получении положительного результата в МР пациент должен обследоваться дерматовенерологом с повторным исследованием крови в любом диагностическом тесте на сифилис.
При профилактическом обследовании на сифилис больных глазных, психоневрологических, кардиологических стационаров, беременных, в частности, направляемых на искусственное прерывание беременности, должны использоваться КСР, ИФА или РПГА.
При обследовании доноров необходимо применять КСР или ИФА или РПГА, но обязательно в сочетании с МР. Постановка двух реакций одновременно обусловлена высокой ответственностью данного исследования.
МР в количественном варианте с экономической точки зрения необходимо использовать в качестве контроля эффективности лечения, заменив ею количественную постановку РСК с кардиолипиновым антигеном.
Вышеуказанные специфические тесты служат для диагностики всех форм сифилиса, в частности, скрытого, а также для распознавания ложноположительных результатов, полученных в МР и КСР. При диагностике скрытого сифилиса целесообразна постановка двух специфических тестов одновременно.
Поскольку ИФА и РПГА являются более высокочувствительными, специфическими и воспроизводимыми тест — системами, которые можно использовать в качестве отборочных и подтверждающих тестов, осуществить до 2006 г. замену комплекса серореакций (КСР) вышеуказанными реакциями при диагностике сифилиса.
Таким образом, последовательность обследования пациентов на сифилис представляется следующим образом:
— при первичном обследовании производится постановка отборочной (скрининговой) реакции микропреципитации (РМП) или ее модификации (RPR- РПР, TRUST — ТРАСТ, VDRL — ВДРЛ) в количественном и качественном вариантах и в случае положительного результата — любого специфического подтверждающего трепонемного теста (РПГА, ИФА, КСР, РИФ, РИТ);
— после окончания терапии ставится РМП или ее модификация и по снижению титра судят о динамике инфекционного процесса и эффективности терапии. Подтверждением эффективности проведенной терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года;
— по окончании этого срока осуществляется постановка той же специфической реакции, что и при первичном обследовании. Следует учитывать, что специфические трепонемные тесты могут оставаться положительными (не негативировать) в течение ряда лет, а в отдельных случаях остаются положительными на всю жизнь.
Методика постановки и суть различных модификаций МР, ИФА, РПГА, РИФ, РСК и РИТ подробно описаны в настоящих Методических указаниях.
Формула метода
Впервые детально описаны 6 методов, используемых для серо- и ликвородиагностики сифилиса включающих 15 модификаций. Рекомендована замена РСК при определении эффективности лечения сифилиса МР, что дает экономический эффект. Введена в инструкцию количественная методика постановки РИТ, расширяющая возможности поздних форм сифилиса. Включены методики постановки РСК, РИТ, РИФ-ц и ИФА для ликвородиагностики сифилиса.
Показания к применению метода
Серо- и ликвородиагностика всех форм сифилиса.
Противопоказаний нет.
МИКРОРЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ С КАРДИОЛИПИНОВЫМ АНТИГЕНОМ
(ЭКСПРЕСС — МЕТОД)
Принцип. При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген — антитело), выпадающий в виде хлопьев белого цвета.
Материально — техническое обеспечение метода
Оборудование для взятия крови и постановки МР:
— капиллярные пипетки аппарата Панченкова;
— градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл;
— автоматические пипетки на 20-200 мкл;
— наконечники для автоматических пипеток;
— пробирки длиной 8-10 см и 14-15см, диаметром 1-1,5 см или центрифужные;
— пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2 см, глубиной не менее 0,5 см;
— иглы для взятия крови из пальца и вены; шприцы;
— центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин;
— аппарат для встряхивания;
— стерилизатор для кипячения игл, шприцов, инструментов.
Ингредиенты для МР:
— антиген кардиолипиновый для микрореакции;
— холин — хлорид (включается в упаковку с антигеном);
— натрий хлорид х.ч.;
— натрий лимоннокислый (цитрат натрия)трехзамещенный
Na C H O 5H O;
3 6 5 7 2
— мертиолат C H O S Na Hg.
9 9 2
Растворы:
— изотонический раствор натрия хлорида 0,9%;
— 10% раствор холин — хлорида готовится следующим
образом: к 29,65 мл изотонического раствора натрия
хлорида добавляют 0,35 мл 0,01% раствора мертиолата
и 5 мл 70% раствора холин — хлорида. Смесь тщательно
перемешивают. При отсутствии мертиолата для
приготовления 10% раствора холин — хлорида
необходимо к 30 мл стерильного изотонического
раствора натрия хлорида добавить 5 мл 70% раствора
холин — хлорида;
— 5% раствор трехзамещенного цитрата натрия
готовится на дистиллированной воде и фильтруется.
Раствор не стоек. При помутнении его надо заменять
свежим. Хранится в холодильнике при 4 град. в
течение 5-6 дней.
Контрольные лиофилизированные сыворотки крови необходимы для установления пригодности эмульсии антигена. Отрицательную и положительную контрольные сыворотки крови используют неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем ее разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена. При отсутствии лиофилизированных сывороток крови используют нативную положительную или смесь положительных в РСК с кардиолипиновым антигеном или микрореакции инактивированных сывороток крови, которые разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно закрывающимися пробками, хранят в морозильном отделении холодильника, используют с титром выше 1:8. В день постановки реакции сыворотку крови титруют на пластинке с целью подтверждения ранее установленного титра, для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня.
Титрование контрольной сыворотки проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл контрольной сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пипеткой, насасывая и выпуская его в лунку 5-6 раз. Затем набирают 90 мкл содержимого второй лунки в пипетку и 90 мкл переносят в третью лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким же образом и переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки 90 мкл удаляют. Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластинку встряхивают в аппарате в течение 5 минут, добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после чего регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (+/ 2+), используют в качестве слабоположительного контроля. Для получения его делают соответствующее разведение. Например, если слабоположительный результат получен с разведением сыворотки крови 1:8, то для получения контрольной слабоположительной сыворотки крови в пробирку вносят 0,7 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.
При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения наблюдается равномерное уменьшение величины хлопьев преципитата.
При снижении реактивности хранящейся нативной контрольной сыворотки крови используют разведение, дающее слабоположительный результат при повторном титровании. Контрольную сыворотку крови можно использовать до тех пор, пока она дает положительный результат (4+) в разведении не ниже 1:2, и слабоположительный результат (2+) в разведении не меньше 1:4. При дальнейшем снижении реактивности употреблявшуюся положительную контрольную сыворотку крови заменяют новой.
При
По материалам www.lawmix.ru
Приказ Минздрава РФ от 26 марта 2001 г. N 87
«О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»
См. указание Минздрава РФ от 21 марта 2003 г. N 278-У о проведении Всероссийского совещания по выполнению настоящего приказа
См. также Протокол ведения больных «Сифилис», утвержденный приказом Минздрава РФ от 25 июля 2003 г. N 327
Эпидемиологическая ситуация с заболеваемостью сифилисом остается крайне напряженной. С начала 90-х годов она возросла почта в 40 раз и в 1999 г. достигла 186,7 случаев на 100 тыс. населения.
Серьезность ситуации усугубляется тем, что сифилис, как и другие инфекции, передаваемые половым путем, способствует распространению ВИЧ-инфекции.
Одним из основных мероприятий, направленных на предупреждение дальнейшего распространения заболеваемости сифилисом, является его ранняя диагностика.
Однако материально-техническая база серологических лабораторий не соответствует потребностям учреждений здравоохранения. За последние десять лет число кожно-венерологических диспансеров, не имеющих в своем составе серологических лабораторий, возросло с 25,3% в 1989 г. до 31,2% в 1999 г.
С целью совершенствования лабораторной диагностики сифилиса, повышения качества работы и обеспечения единства подхода по ее организации: приказываю:
1.1. Методические указания «Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис» (приложение N 1).
1.2. Методические указания «Расчетные нормы времени проведения лабораторных исследований при диагностике сифилиса методом реакции пассивной гемаглюцинации» (приложение N 2).
2. Директору Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического института Минздрава России А.А.Кубановой, директору Уральского научно-исследовательского института дермато-венерологии и иммунопатологии Минздрава России Н.В.Кунгурову, директору Нижегородского научно-исследовательского кожно-венерологического института Минздрава России Н.К.Никулину:
2.1. Обеспечить организационно-методическое руководство по внедрении диагностических тестов в субъектах Российской Федерации в соответствии с приложениями N 1 и N 2.
2.2. До 01.06.2001 подготовить и представить в установленном порядке необходимые материалы на аккредитацию серологических лабораторий научно-исследовательских институтов в качестве экспертных в здравоохранении.
2.3. Обеспечить проведение внешнего контроля качества лабораторной диагностики сифилиса.
3. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов Российской Федерации:
3.1. Организовать работу по серологической диагностике сифилиса в соответствии с приложениями N 1, N 2.
3.2. Принять неотложные меры по развитию и укреплению материально-технической базы серологических лабораторий, обратив особое внимание на организацию таких лабораторий в составе кожно-венерологических диспансеров.
4. Считать не действующим на территории Российской Федерации приказ Министерства здравоохранения СССР от 2 сентября 1985 г. N 1161 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса».
5. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на Первого заместителя Министра А.И.Вялкова.
По материалам base.garant.ru
ПРИКАЗ Минздрава РФ от 26.03.2001 N 87 «О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА»
Эпидемиологическая ситуация с заболеваемостью сифилисом остается крайне напряженной. С начала 90-х годов она возросла почти в 40 раз и в 1999 г. достигла 186,7 случаев на 100 тыс. населения.
Серьезность ситуации усугубляется тем, что сифилис, как и другие инфекции, передаваемые половым путем, способствует распространению ВИЧ — инфекции.
Одним из основных мероприятий, направленных на предупреждение дальнейшего распространения заболеваемости сифилисом, является его ранняя диагностика.
Однако материально — техническая база серологических лабораторий не соответствует потребностям учреждений здравоохранения. За последние десять лет число кожно — венерологических диспансеров, не имеющих в своем составе серологических лабораторий, возросло с 25,3% в 1989 г. до 31,2% в 1999 г.
С целью совершенствования лабораторной диагностики сифилиса, повышения качества работы и обеспечения единства подхода по ее организации: приказываю:
1.1. Методические указания «Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис» (приложение N 1).
1.2. Методические указания «Расчетные нормы времени проведения лабораторных исследований при диагностике сифилиса методом реакции пассивной гемагглютинации» (приложение N 2)
2. Директору Центрального научно — исследовательского кожно — венерологического института Минздрава России А.А.Кубановой, директору Уральского научно — исследовательского института дермато — венерологии и иммунопатологии Минздрава России Н.В.Кунгурову, директору Нижегородского научно — исследовательского кожно — венерологического института Минздрава России Н.К.Никулину:
2.1. Обеспечить организационно — методическое руководство по внедрению диагностических тестов в субъектах Российской Федерации в соответствии с приложениями N 1 и N 2.
2.2. До 01.06.2001 подготовить и представить в установленном порядке необходимые материалы на аккредитацию серологических лабораторий научно — исследовательских институтов в качестве экспертных в здравоохранении.
2.3. Обеспечить проведение внешнего контроля качества лабораторной диагностики сифилиса.
3. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов Российской Федерации:
3.1. Организовать работу по серологической диагностике сифилиса в соответствии с приложениями N 1, N 2.
3.2. Принять неотложные меры по развитию и укреплению материально — технической базы серологических лабораторий, обратив особое внимание на организацию таких лабораторий в составе кожно — венерологических диспансеров.
4. Считать не действующим на территории Российской Федерации приказ Министерства здравоохранения СССР от 2 сентября 1985 г. N 1161 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса».
5. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на Первого заместителя Министра А.И.Вялкова.
УТВЕРЖДЕНО
Приказом Минздрава России
от 26.03.2001 г. N 87
Методические указания предназначены для лабораторных работников и клиницистов дерматовенерологической службы России. Указания посвящены современным методам серо- и ликвородиагностики сифилиса, широко апробированным в научно — исследовательских и лечебно — профилактических учреждениях страны. Представлены новые высоко чувствительные специфичные методики постановки реакций на сифилис. Освещено предназначение различных тестов в качестве отборочных, диагностических и контрольных для оценки эффективности лечения. Описаны принципы реакций, методики их постановки, материально — техническое обеспечение, источники получения ошибочных результатов и мероприятия по технике безопасности при работе с инфекционным материалом.
Организация — разработчик: ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ.
Авторы: докт. биол. наук, проф. Г.А.Дмитриев, докт. мед. наук, проф. В.Н.Беднова, докт. мед. наук Г.Ф.Тимченко, канд. мед. наук Г.А.Киселева, канд. мед. наук Т.И.Милонова, канд. мед. наук О.А.Стоянова, З.П.Акопова.
Для серо- и ликвородиагностики сифилиса в России могут применяться следующие методы:
1. Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР), которая является отборочным тестом при обследовании населения на сифилис. Постановка МР осуществляется с плазмой или инактивированной сывороткой крови. Зарубежные тесты ВДРЛ (VDRL), РПР (RPR) и другие аналогичные МР как по принципу постановки реакции, так и по чувствительности и специфичности.
2. Иммуноферментный анализ (ИФА). Антиген из культуральных или патогенных бледных трепонем.
3. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Антиген из культуральных или патогенных бледных трепонем.
4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ-абс, РИФ-ц, РИФ с капиллярной кровью из пальца. Антиген — патогенная бледная трепонема штамма Никольса.
5. Комплекс серологических реакций на сифилис (КСР), состоящий из реакции связывания комплемента (РСК) с трепонемным и кардиолипиновым антигенами, и МР. Поскольку трепонемный антиген является специфическим, КСР относится к диагностическим тестам. В связи с разработкой более чувствительных, специфичных и менее трудоемких реакций стало возможным заменить при постановке КСР реакцию связывания комплемента на ИФА или РПГА также в сочетании с МР.
6. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), в которой в качестве антигена используют патогенные бледные трепонемы штамма Никольса.
РИТ, РИФ, ИФА и РПГА являются высокочувствительными и высокоспецифичными реакциями на сифилис. Они относятся к диагностическим подтверждающим тестам. При этом в связи с простотой постановки и наличием коммерческих тест — систем ИФА и РПГА могут быть и высокоэффективными отборочными тестами.
Ввиду различной чувствительности при разных формах сифилиса, специфичности и сложности постановки каждая из указанных реакций имеет свое предназначение.
Профилактическое обследование населения на сифилис можно проводить с помощью МР, КСР, ИФА и РПГА. Все организационные вопросы по применению данных реакций с этой целью решаются органами здравоохранения на местах в зависимости от местных условий и возможностей.
При получении положительного результата в МР пациент должен обследоваться дерматовенерологом с повторным исследованием крови в любом диагностическом тесте на сифилис.
При профилактическом обследовании на сифилис больных глазных, психоневрологических, кардиологических стационаров, беременных, в частности, направляемых на искусственное прерывание беременности, должны использоваться КСР, ИФА или РПГА.
При обследовании доноров необходимо применять КСР или ИФА или РПГА, но обязательно в сочетании с МР. Постановка двух реакций одновременно обусловлена высокой ответственностью данного исследования.
МР в количественном варианте с экономической точки зрения необходимо использовать в качестве контроля эффективности лечения, заменив ею количественную постановку РСК с кардиолипиновым антигеном.
Вышеуказанные специфические тесты служат для диагностики всех форм сифилиса, в частности, скрытого, а также для распознавания ложноположительных результатов, полученных в МР и КСР. При диагностике скрытого сифилиса целесообразна постановка двух специфических тестов одновременно.
Поскольку ИФА и РПГА являются более высокочувствительными, специфическими и воспроизводимыми тест — системами, которые можно использовать в качестве отборочных и подтверждающих тестов, осуществить до 2006 г. замену комплекса серореакций (КСР) вышеуказанными реакциями при диагностике сифилиса.
Таким образом, последовательность обследования пациентов на сифилис представляется следующим образом:
— при первичном обследовании производится постановка отборочной (скрининговой) реакции микропреципитации (РМП) или ее модификации (RPR- РПР, trUST — ТРАСТ, VDRL — ВДРЛ) в количественном и качественном вариантах и в случае положительного результата — любого специфического подтверждающего трепонемного теста (РПГА, ИФА, КСР, РИФ, РИТ);
— после окончания терапии ставится РМП или ее модификация и по снижению титра судят о динамике инфекционного процесса и эффективности терапии. Подтверждением эффективности проведенной терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года;
— по окончании этого срока осуществляется постановка той же специфической реакции, что и при первичном обследовании. Следует учитывать, что специфические трепонемные тесты могут оставаться положительными (не негативировать) в течение ряда лет, а в отдельных случаях остаются положительными на всю жизнь.
Методика постановки и суть различных модификаций МР, ИФА, РПГА, РИФ, РСК и РИТ подробно описаны в настоящих Методических указаниях.
Впервые детально описаны 6 методов, используемых для серо- и ликвородиагностики сифилиса включающих 15 модификаций. Рекомендована замена РСК при определении эффективности лечения сифилиса МР, что дает экономический эффект. Введена в инструкцию количественная методика постановки РИТ, расширяющая возможности поздних форм сифилиса. Включены методики постановки РСК, РИТ, РИФ-ц и ИФА для ликвородиагностики сифилиса.
Серо- и ликвородиагностика всех форм сифилиса.
Оборудование для взятия крови и постановки МР:
— капиллярные пипетки аппарата Панченкова;
— градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл;
— автоматические пипетки на 20-200 мкл;
— наконечники для автоматических пипеток;
— пробирки длиной 8-10 см и 14-15см, диаметром 1-1,5 см или центрифужные;
— пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2 см, глубиной не менее 0,5 см;
— иглы для взятия крови из пальца и вены; шприцы;
— центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин;
— стерилизатор для кипячения игл, шприцов, инструментов.
Контрольные лиофилизированные сыворотки крови необходимы для установления пригодности эмульсии антигена. Отрицательную и положительную контрольные сыворотки крови используют неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем ее разведения по титру, установленному в день приготовления эмульсии антигена. При отсутствии лиофилизированных сывороток крови используют нативную положительную или смесь положительных в РСК с кардиолипиновым антигеном или микрореакции инактивированных сывороток крови, которые разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно закрывающимися пробками, хранят в морозильном отделении холодильника, используют с титром выше 1:8. В день постановки реакции сыворотку крови титруют на пластинке с целью подтверждения ранее установленного титра, для контроля качества эмульсии и получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня.
Титрование контрольной сыворотки проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл контрольной сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают пипеткой, насасывая и выпуская его в лунку 5-6 раз. Затем набирают 90 мкл содержимого второй лунки в пипетку и 90 мкл переносят в третью лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким же образом и переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки 90 мкл удаляют. Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластинку встряхивают в аппарате в течение 5 минут, добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после чего регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (+/ 2+), используют в качестве слабоположительного контроля. Для получения его делают соответствующее разведение. Например, если слабоположительный результат получен с разведением сыворотки крови 1:8, то для получения контрольной слабоположительной сыворотки крови в пробирку вносят 0,7 мл изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.
При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения наблюдается равномерное уменьшение величины хлопьев преципитата.
При снижении реактивности хранящейся нативной контрольной сыворотки крови используют разведение, дающее слабоположительный результат при повторном титровании. Контрольную сыворотку крови можно использовать до тех пор, пока она дает положительный результат (4+) в разведении не ниже 1:2, и слабоположительный результат (2+) в разведении не меньше 1:4. При дальнейшем снижении реактивности употреблявшуюся положительную контрольную сыворотку крови заменяют новой.
При хранении контрольных сывороток крови не допускаются повторные замораживания их и оттаивание, т.к. в этом случае реактивность их снижается.
О снижении реактивности контрольной сыворотки крови, а не эмульсии антигена, судят по параллельному титрованию этой сыворотки крови с использованием хранившейся и вновь приготовленной эмульсии. Если получают один и тот же титр антител в МР с обеими антигенными эмульсиями, то считают, что снижение реактивности зависит от хранения контрольной сыворотки крови, если же снижение реактивности наблюдают только при использовании хранившейся эмульсии антигена, то это обусловлено снижением реактивности эмульсии антигена, которую необходимо заменить свежеприготовленной.
Серологические лаборатории кожно — венерологических диспансеров должны снабжать контрольными сыворотками крови лаборатории района, использующие в своей работе экспресс — метод и не имеющие положительных и отрицательных сывороток крови. При отсутствии контрольных сывороток крови реакцию ставить нельзя.
Эмульсия кардиолипинового антигена готовится из специального кардиолипинового антигена для микрореакции преципитации. Нельзя использовать в микрореакции кардиолипиновый антиген, предназначенный для реакции связывания комплемента.
Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на прозрачность ампулированного антигена. При выпадении кристаллов холестерина их растворяют нагреванием ампул в термостате или водяной бане при 37 град. С или 56 град. С соответственно.
Прежде чем приготовить эмульсию, рассчитывают необходимое количество ее на рабочий день или рабочую неделю (на 50 исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена). В пробирку вносят сухой пипеткой не более 2 мл антигена, добавляя его к равному объему 0,9% изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 минут, затем центрифугируют при 1000 об/мин до получения прозрачной жидкости, которую удаляют, а к осадку добавляют 3,5 объема (по отношению к взятому антигену) 10% раствора холин — хлорида. Например, если требуемый объем антигена равен 0,5 мл, то для вычисления количества холин — хлорида 0,5 мл умножают на 3,5 и получают 1,75 мл, т.е. необходимый объем холин — хлорида. Пробирку плотно закрывают пробкой и содержимое перемешивают, опрокидывая пробирку, до полного ресуспендирования. Полученная эмульсия готова к употреблению. При необходимости приготовления большого количества эмульсии, ее готовят не в одном флаконе большой емкости, а в нескольких пробирках, внося в каждую из них по 2 мл антигена. Такие объемы обеспечивают лучшее перемешивание антигена, предохраняют его от загрязнений при повторном взятии для постановки реакции, а также от нагревания и действия солнечных лучей.
Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4 град. не более недели, а при добавлении раствора мертиолата — в течение 2 недель. В день постановки реакции нужное для данного рабочего дня количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для согревания при комнатной температуре на 30 минут и перемешивают ее, опрокидывая пробирку, закрытую пробкой, не менее 30 раз, затем проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови. Применяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув пробирки с ней черной бумагой. Пригодность каждой новой серии антигена проверяют в экспресс — методе одновременно с уже бывшей в работе серией на заведомо положительных и отрицательных сыворотках крови. О пригодности антигена судят по величине титров, наблюдаемых при одновременном титровании положительных сывороток крови с новой и проверенной сериями антигенов. Получение близких результатов, т.е. величин титров реагентов, отличающихся на +/-1 разведение, одинаковой выраженности хлопьев преципитата, наблюдаемых в одних и тех же разведениях положительных сывороток крови свидетельствует о пригодности исследуемой серии антигена. Серию антигена бракуют, если одновременное титрование контрольной положительной сыворотки крови с новой серией антигена показывает: а)слабо выраженный преципитат (2+/1+) при минимальных разведениях сыворотки крови; б) более низкий (на 2-3 разведения) титр реагинов, чем с употреблявшейся проверенной серией; в) наличие преципитата в отрицательных сыворотках крови.
Кровь берут из пальца так же, как для исследования скорости оседания эритроцитов (СОЭ). При взятии крови смачивают капилляр аппарата Панченкова 5% раствором цитрата натрия, набрав раствор до метки «25», а оставшийся цитрат натрия выливают в центрифужную пробирку, куда затем вносят три капилляра крови, взятой до метки «К», перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а в экстренных случаях центрифугируют с целью получения плазмы крови, которую отсасывают автоматической пипеткой для проведения исследования.
Получение инактивированной сыворотки крови: Кровь берут из вены, получают сыворотку крови и инактивируют ее так же, как для РСК.
Методика постановки микрореакции:
Качественную и количественную постановки микрореакции с испытуемой плазмой и инактивированной сывороткой крови следует осуществлять следующим образом.
При использовании качественной методики постановки микрореакции автоматической пипеткой забирают по 90 мкл плазмы или инактивированной сыворотки крови и вносят в лунки, куда затем добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. В каждую лунку вносят плазму или сыворотку крови от одного обследуемого и нумеруют соответственно списку в регистрационном журнале. Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины во встряхивателе (100 качаний в 1 минуту) в течение 5 минут, затем в каждую лунку добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28 град.). Результаты учитывают только после появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке крови.
При использовании количественной методики постановки микрореакции в 9 лунок горизонтального ряда пластины, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл исследуемой плазмы или сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают автоматической пипеткой, забирая его и выпуская из нее в лунку 5-6 раз, затем забирают 90 мкл и переносят в третью лунку. Из третьей лунки 90 мкл переносят в четвертую и т. д. по десятую лунку, из которой 90 мкл удаляют. Таким образом получают двукратные разведения плазмы или сыворотки крови 1:2, 1:4, 1:8 и далее до 1:516. В первую лунку изотонический раствор натрия хлорида не приливают, а вносят только 90 мкл плазмы или сыворотки крови, т.е. исследуют цельную плазму или сыворотку крови. Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластину встряхивают 5 минут, после чего во все лунки добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида. Через 5 минут регистрируют результаты так же, как при постановке качественной реакции.
Титром преципитинов считают последнее разведение плазмы или сыворотки крови, где обнаружен преципитат. Величина титра указывает на активность процесса, а его снижение во время лечения — на эффективность терапии. Стабильность титров настораживает клиницистов в отношении эффективности терапии, увеличение же их требует пересмотра лечения.
Для получения достоверных результатов следует пользоваться одной и той же серией препарата при обследовании больного в процессе лечения, что относится ко всем реакциям на сифилис.
К моменту снятия леченного больного с учета неспецифические тесты с кардиолипиновым антигеном обычно негативируются, в то время как позитивность специфических реакций может наблюдаться долго после окончания лечения, в связи с чем эти тесты не могут служить критерием излеченности и больные снимаются с учета с положительными результатами РИТ, РИФ, ИФА, РПГА.
Источники ошибок при постановке МР:
— неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха в капилляре пипеток);
— исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности, слабоположительных;
— неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания ее перед использованием;
— бактериальное загрязнение эмульсии;
— нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена и его эмульсии, растворов;
— замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным;
— использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, пластинок, растворов.
Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.
Лаборатории, в которых осуществляется постановка ИФА, должны быть укомплектованы:
— набором автоматических пипеток (микродозаторов), который включает в себя одноканальные пипетки переменного объема, рассчитанные на дозирование 5-40, 40-200 и 200-1000 мкл жидкости, а также 8-канальные пипетки переменного объема на 5-50 (при использовании тест — систем с рабочим разведением образцов 1:100 и 1:200) и 50-300 мкл;
— набором мерной химической посуды;
— термостатом, рассчитанным на поддержание температуры 37 град. С;
— дистиллятором лабораторным для получения дистиллированной воды;
Результаты ИФА с сывороткой крови и ликвором при использовании всех тест — систем с автоматическим учетом регистрируют на спектрофотометре для планшетов немедленно после постановки реакции с измерением оптической плотности (ОП) раствора субстрата при длине волны 492 нм.
Выведение спектрофотометра на нулевой уровень («бланк») осуществляют по воздуху. Учет результатов реакции проводят согласно методике и цифровым данным, изложенным в инструкции по применению, имеющейся в каждом используемом наборе. При автоматическом учете результатов реакции по величине цифровых показателей ОП в лунках с испытуемыми образцами судят о концентрации специфических антител в исследуемой сыворотке крови и ликворе. В связи с этим данный метод оценки результатов называют количественным. При каждой постановке ИФА рассчитывают критическое значение ОП (ОПкрит.) и «серую зону». «Серой зоной» является интервал от ОПкрит. — 10% до ОПкрит. + 10%. Исследуемый образец учитывают как положительный, если ОП данного образца выше «серой зоны», как сомнительный, если ОП находится в пределах «серой зоны», и как отрицательный, если ОП ниже «серой зоны». Так учитывают результаты во всех тест — системах, кроме тест — системы «ЛюисСкрин». В тест — системе «ЛюисСкрин» исследуемая сыворотка расценивается как положительная, если ее ОП превышает ОП отрицательного контроля не менее, чем в 2 раза.
К сожалению, при учете результатов реакции все ИФА тест — системы невозможно привести к единому стандарту. Один и тот же образец может давать в разных тест — системах совершенно разный уровень окрашивания раствора субстрата. Это зависит от конструкции самой тест — системы, используемого антигена, концентрации конъюгата и др., а также от величины ОПкрит. Поэтому более точной оценкой результатов ИФА является титр противотрепонемных антител каждого положительного образца. С целью определения титра производят последовательные 2-кратные разведения испытуемой сыворотки крови, давшей положительный результат. За титр принимают наибольшее разведение сыворотки, дающее положительный результат. Следовательно, титр является количественным показателем уровня специфических антител в данном образце и степени его позитивности. Но следует учитывать, что повторное исследование сыворотки крови должно осуществляться с той же тест — системой, так как титр антител в одном и том же образце может быть различным при использовании разных тест — систем.
При применении тест — системы с визуальным учетом результатов также рекомендуется определение титров противотрепонемных антител в резко положительных сывороточных образцах (4+).
Отрицательной чертой количественного метода исследования с целью определения титра антител в сыворотке крови и ликворе является его неэкономичность. В связи с этим целесообразно использовать другой критерий для характеристики концентрации антител — коэффициент позитивности (КП), равный отношению оптической плотности, полученной для каждого образца, к критической оптической плотности: КП = ОП/ОПкрит. КП у положительных образцов выше 1,1, сомнительных — находится в интервале от 0,9 до 1,1 и отрицательных — ниже 0,9. Определение КП целесообразно проводить при выяснении динамики выработки антител у пациента в процессе наблюдения за ним после лечения сифилиса, при этом обязательно нужно использовать ту же тест — систему, что и до лечения больного. Эта методика не требует дополнительных финансовых затрат и дает представление об эффективности лечения.
При использовании тест — системы иммуноферментной для качественного выявления антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови человека («АТ-Треп.-ИФТС», г. Ставрополь) возможен только визуальный учет результатов реакции. При резко положительном (4+) результате субстратная смесь имеет темно — коричневый цвет, при положительном (3+) — коричневый цвет, при слабоположительном (2+) — светло — коричневый, при отрицательном (+,-) — светло — бежевый цвет или бесцветна.
Образцы, для которых получен сомнительный результат (соответствующая им ОП находится в пределах «серой зоны» и КП в интервале от 0,9 до 1,1) подлежат повторному анализу. При повторном сомнительном результате рекомендуется анализ с новой порцией крови, взятой через 3-7 дней.
Для ликвородиагностики сифилиса могут быть использованы отечественные тест — системы ИФА, предназначенные для выявления иммуноглобулинов класса О и работающие по первой схеме проведения реакции. В настоящее время такими тест — системами являются:
1. Тест — система иммуноферментная для выявления антител к Treponema pallidum в сыворотке или плазме крови человека «РекомбиБест антипаллидум» и «РекомбиБест антипаллидум — стрип» производства ЗАО «Вектор — Бест» (п. Кольцово Новосибирской области); 2. Тест — система иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса «ИФА — АНТИ — LUIS» производства НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород); 3. Тест — система иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса (Treponema pallidum)Ha основе рекомбинантных белков производства БТК «Биосервис» (г. Москва).
Ликвор в реакцию вводят цельным и неинактивированным. Мутный или с примесью крови ликвор центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость. Перед исследованием ликвор можно сохранять в морозильном отделении холодильника при температуре от -12 град.С до -18 град. С в пробирках под резиновыми пробками или в «эппендорфах» до 1 месяца. Размораживание производят при комнатной температуре. Повторное замораживание и размораживание не допускается.
При исследовании ликвора приготовление рабочих растворов, проведение ИФА и учет результатов осуществляют в соответствии с инструкцией по применению тест — систем, за исключением пунктов, касающихся разведения ликвора и приготовления рабочих растворов конъюгата. Так, исследование ликвора в отличие от исследования сыворотки или плазмы крови проводят в первой фазе реакции при его разведении 1:2 (50 мкл ликвора и 50 мкл раствора для разведения) и во второй фазе реакции с рабочим раствором конъюгата, концентрация которого увеличена в 4 раза по сравнению с указанной в инструкции для сыворотки или плазмы крови.
Количественными показателями концентрации противотрепонемных антител (степени позитивности) в ликворе являются титр противотрепонемных антител или коэффициент позитивности. Определение титров или коэффициентов позитивности целесообразно проводить как до лечения, так и после него для выяснения динамики выработки антител с использованием одной и той же тест — системы.
По своей диагностической эффективности при ликвородиагностике сифилиса ИФА близок к РИФ-ц, самой чувствительной и специфичной реакции при диагностике нейросифилиса. Положительной чертой ИФА является его доступность благодаря наличию производственных высококачественных тест — систем.
Источники возникновения ошибок при использовании ИФА-тест — систем делятся на вне- и внутрилабораторные. К первым относятся: нарушения техники взятия крови, условий транспортировки и хранения тест — систем и проб. Ко вторым — некачественная работа лаборантов, любые отклонения от инструкции по применению тест — системы, неисправность инструментов и приборов, неаккуратность ведения документации.
Чтобы избежать ошибок при проведении ИФА, необходимо придерживаться следующих правил:
— не использовать для исследования хилезные, резко гемолизированные и проросшие сыворотки крови, добиваясь стандартных условий взятия и хранения образцов;
— не практиковать 2-кратного и более замораживания — размораживания образцов сыворотки крови;
— не пользоваться просроченными наборами тест — систем;
— соблюдать стандартные требования к чистоте лабораторной посуды; использовать отдельные посуду и наконечники для автоматических пипеток (при их многократном использовании) для разведения конъюгатов и субстрата пероксидазной реакции (ОФД);
— проводить периодический контроль качества работы лаборантов;
— следить за строгим соблюдением инструкций по применению тест — систем;
— пользоваться автоматическими пипетками с погрешностью измерения объемов не более 5%, ежемесячно проводя метрологический контроль их работы;
— соблюдать правила эксплуатации оборудования (спектрофотометры, автоматические промыватели планшет, рН-метры);
— спектрофотометры для ИФА должны не реже одного раза в год проходить метрологический контроль, периодическому контролю подлежат также автоматические пипетки, термостаты, рН-метры;
— в ходе каждой постановки ИФА заполнять протокол исследования.
Главным достоинством ИФА является наличие отечественного выпуска тест — систем, их высокое качество, возможность автоматизации постановки и учета его результатов, что крайне важно при исследовании большого числа сывороток крови, в частности от доноров. При использовании тест — систем ИФА для лабораторий с небольшим объемом работы следует закупать тест — системы с разборными планшетами (стрипы).
ИФА диагностика сифилиса — эффективный метод. Необходимым является его более широкое использование в качестве скринингового и диагностического теста на сифилис, но обязательным при этом должно быть высокое качество выпускаемых предприятием тест — систем. Недопустима продажа и использование в медицинской практике тест — систем, не имеющих утвержденной фармакопейной статьи и разрешения Минздрава РФ на их применение в практике здравоохранения. Все утвержденные и рекомендованные в практику ИФА тест — системы прошли государственные испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича и в ЦНИКВИ. В процессе их промышленного выпуска должен осуществляться систематический контроль качества. К применению в медицинской практике разрешаются тест — системы, чувствительность и специфичность которых не ниже 95%.
Принцип метода заключается в том, что при соединении сыворотки крови, содержащей специфические антитела, с эритроцитами, сенсибилизированными соответствующим антигеном, наблюдается их характерная агглютинация. Постановка реакции может осуществляться в пробирках или планшетах.
Сенсибилизация эритроцитов при изготовлении тест — системы для диагностики сифилиса может производиться патогенными или культуральными бледными трепонемами.
Помимо наших производителей, ряд зарубежных фирм поставляет свою продукцию в Россию.
1. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против Treponema pallidum («Syphilis TPHA — test»), фирма «Human», страна — производитель — Германия, распространитель — фирмы: «Биохиммак», «Лабораторная диагностика», г. Москва.
2. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против Treponema pallidum («TPHA — nosticon»), фирма «Organon», страна — производитель — Голландия, распространитель — фирма «Organon — technics», г. Москва.
3. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против Treponema pallidum («Syphilia TPHA 200»), фирма «Sanofi diagnostic Pasteur», страна — производитель — Франция, распространитель — фирма «Sanofi diagnostic Pasteur», г. Москва.
4. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против Treponema pallidum («Syphilis TPHA»), фирма «Randox», страна — производитель — Великобритания, распространитель — фирма ЗАО «Protea», г. Москва.
5. Диагностикум для выявления антител к Treponema pallidum в реакции пассивной гемагглютинации («Люис РПГА тест»), фирма «Ни-армедик Плюс», г. Москва.
В ЦНИКВИ на большом материале с отечественным диагностикумом изучена результативность РПГА по сравнению с другими тестами на сифилис при исследовании сывороток крови больных с различными формами сифилиса до лечения. В РПГА получено 99,4% положительных результатов, в РИФ-абс — 99,1%, РИФ-200 — 99,1%, РИТ — 87,7%, МР — 95,8%, в РСК с трепонемным антигеном — 95,8%, РСК с кардиолипиновым антигеном — 90,2%. В зарубежной литературе имеются указания на более позднюю выработку гемагглютининов у больных в ранний период заболевания, хотя в ЦНИКВИ выявлен высокий процент положительных результатов при сифилисе первичном, серопозитивном — 97,7%.
Общее мнение исследователей заключается в том, что РПГА является ценным диагностическим тестом при всех формах сифилиса, но особенно чувствительна она при поздних формах заболевания.
Существует микро- и макромодификации постановки РПГА, чаще используется первая из-за экономичности, быстроты постановки и учета результатов. Кроме того, есть качественный и количественный варианты постановки. Последний позволяет определять титры антител в крови. Но при этом, необходимо учесть, что при повторных исследованиях крови в РПГА необходимо использовать одну и ту же тест — систему.
Результаты РПГА учитывают через 1,5-2 ч при микрометоде или на следующий день при макрометоде. Неподвижно стоящие пластины даже при высыхании их содержимого сохраняют полученную картину:
«4+» — положительная РПГА. Эритроциты равномерно выстилают всю поверхность лунки (в виде зонтика).
«3+» — положительная РПГА. Эритроциты выстилают всю поверхность лунки, но часть их соскальзывает к центру.
«2+» — слабоположительная РПГА. Эритроциты образуют пленку на небольшом участке нижней части лунки.
«1+» — отрицательный результат РПГА. На дне лунки эритроциты образуют рыхлый осадок.
«-» — отрицательная РПГА. Эритроциты ровным плотным «колечком» или «пуговкой» лежат на самом дне лунки (без окружающего зернистого осаждения).
Испытание сыворотки крови людей в первых двух разведениях позволяет при качественной постановке реакции быстро выявлять лиц, сыворотки крови которых содержат специфические антитела к антигенам бледной трепонемы. Испытание сыворотки крови количественным методом с помощью двукратных разведений дает дополнительную информацию о концентрации специфических антител в крови.
Принцип метода заключается в соединении специфического комплекса антиген — антитело с иммунной антивидовой сывороткой, меченной флюорохромом, и выявление его с помощью люминесцентного микроскопа.
Материально — техническое обеспечение метода: люминисцентный микроскоп с ртутно — кварцевой лампой ДРШ-250, термостат, инактиватор.
1. Испытуемая сыворотка крови. Кровь для получения сыворотки крови берут из локтевой вены в чистую и сухую пробирку в объеме 5 мл и обрабатывают так же, как для постановки реакции Вассермана. Инактивируют сыворотки крови однократно при температуре 56 град. С в течение 30 минут. В связи с тем, что РИФ-абс ставится нестерильно, использование стерильной посуды, соблюдение условий стерильности при хранении сывороток крови не обязательно. Оно имеет значение только для более длительного сохранения сывороток крови до исследования.
2. Антиген. В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из 7-суточного орхита кролика. Здоровых кроликов — самцов с отрицательными результатами реакции Вассермана и РИТ заражают интратестикулярно и при возникновении орхита извлекают из яичек бледные трепонемы так же, как в случае получения антигена для РИТ. Полученную взвесь бледных трепонем сливают с кусочков яичка в стерильные пробирки с ватными пробками и оставляют в холодильнике при 4 град. С на сутки, после чего отделяют от осадка и при тех же условиях сохраняют весь период использования.
Получение и хранение антигена требует соблюдения условий стерильности, т. к. с одним и тем же антигеном реакция может ставиться в течение 2-4 месяцев. Для антигена следует выбирать ту взвесь, в которой не наблюдается агглютинация трепонем и имеется достаточное их количество. Антиген может быть получен в ампулах из других лабораторий. Перед каждой постановкой реакции взвесь хорошо перемешивают и исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения для определения ее густоты. Для постановки РИФ-абс необходимо иметь взвесь, содержащую 40-60 трепонем в темном поле зрения, при наличии более густой взвеси ее необходимо развести.
3. Сорбент. В качестве сорбента для РИФ-абс может быть использован ультраозвученный трепонемный антиген для РСК. Он представляет собой разрушенную ультразвуком взвесь смеси культуральных бледных трепонем штаммов V, VII, VIII, IX и Рейтера.
Каждая серия сорбента перед использованием в РИФ- абс с диагностической целью должна быть оттитрована.
Титрование сорбентов. Сорбенты титруют на 10 сыворотках крови больных сифилисом, дающих в РИФ-5 с буфером резко (4+) и слабо (2+) положительный результат, а также на 20 сыворотках крови лиц, свободных от сифилитической инфекции, дающих в РИФ-5 отрицательный результат, а также неспецифическую позитивность (2+ и более). При этом для РИФ-5 с буфером люминесцирующая сыворотка должна быть оттитрована также, как для РИФ-абс с ее разведением от 1:100 до 1:140.
Пример определения титра сорбента. Цельный сорбент, разводят фосфатным буфером, РН=7,2 в 2, 3, 4 раза и более. Берут 3 сыворотки крови от больных сифилисом, одна из которых дает в РИФ-5 резкоположительный (4+) результат, две — слабоположительный (2+), и 5 сывороток крови от людей, свободных от сифилитической инфекции, 3 из которых дают неспецифические результаты в РИФ-5 (2+ и более). Все сыворотки крови разводят в 5 раз сорбентом, разведенным в свою очередь в 2, 3, 4 и более раз фосфатным буфером. Затем сыворотки крови исследуют в реакции. После учета результатов выбирают разведение сорбента, при котором сорбированные сыворотки крови больных сифилисом сохраняют степень позитивности, аналогичную полученной с сыворотками крови, разведенными фосфатным буфером, а сыворотки крови лиц, свободных от сифилитической инфекции, не дают свечения. Это разведение сорбента является его титром.
Титром сорбента в данном случае явилось разведение 1:3, при котором все сыворотки крови больных сифилисом сохраняли степень позитивности, полученную в контроле, и в то же время надежно снималась неспецифическая позитивность несифилитических сывороток крови.
Окончательный титр устанавливают в результате исследования 30 сывороток крови больных сифилисом и контрольных лиц.
По материалам zakonbase.ru
Приказ 26 марта 2001 г. N 87 о совершенствовании серологической диагностики сифилиса эпидемиологическая ситуация с заболеваемостью сифилисом
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА
Эпидемиологическая ситуация с заболеваемостью сифилисом
остается крайне напряженной. С начала 90-х годов она возросла
почти в 40 раз и в 1999 г. достигла 186,7 случаев на 100 тыс.
Серьезность ситуации усугубляется тем, что сифилис, как и
другие инфекции, передаваемые половым путем, способствует
распространению ВИЧ — инфекции.
Одним из основных мероприятий, направленных на предупреждение
дальнейшего распространения заболеваемости сифилисом, является его
Однако материально — техническая база серологических
лабораторий не соответствует потребностям учреждений
здравоохранения. За последние десять лет число кожно —
венерологических диспансеров, не имеющих в своем составе
серологических лабораторий, возросло с 25,3% в 1989 г. до 31,2% в
С целью совершенствования лабораторной диагностики сифилиса,
повышения качества работы и обеспечения единства подхода по ее
1.1. Методические указания «Постановка отборочных и
диагностических тестов на сифилис» (приложение N 1).
1.2. Методические указания «Расчетные нормы времени проведения
лабораторных исследований при диагностике сифилиса методом реакции
пассивной гемагглютинации» (приложение N 2)
2. Директору Центрального научно — исследовательского кожно —
венерологического института Минздрава России А.А.Кубановой,
директору Уральского научно — исследовательского института
дермато — венерологии и иммунопатологии Минздрава России
Н.В.Кунгурову, директору Нижегородского научно —
исследовательского кожно — венерологического института Минздрава
2.1. Обеспечить организационно — методическое руководство по
внедрению диагностических тестов в субъектах Российской Федерации
в соответствии с приложениями N 1 и N 2.
2.2. До 01.06.2001 подготовить и представить в установленном
порядке необходимые материалы на аккредитацию серологических
лабораторий научно — исследовательских институтов в качестве
экспертных в здравоохранении.
2.3. Обеспечить проведение внешнего контроля качества
лабораторной диагностики сифилиса.
3. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов
3.1. Организовать работу по серологической диагностике
сифилиса в соответствии с приложениями N 1, N 2.
3.2. Принять неотложные меры по развитию и укреплению
материально — технической базы серологических лабораторий, обратив
особое внимание на организацию таких лабораторий в составе кожно —
4. Считать не действующим на территории Российской Федерации
приказ Министерства здравоохранения СССР от 2 сентября 1985 г.
N 1161 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса».
5. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на
Первого заместителя Министра А.И.Вялкова.
ПОСТАНОВКА ОТБОРОЧНЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ
Методические указания предназначены для лабораторных
работников и клиницистов дерматовенерологической службы России.
Указания посвящены современным методам серо- и ликвородиагностики
сифилиса, широко апробированным в научно — исследовательских и
лечебно — профилактических учреждениях страны. Представлены новые
высоко чувствительные специфичные методики постановки реакций на
сифилис. Освещено предназначение различных тестов в качестве
отборочных, диагностических и контрольных для оценки эффективности
лечения. Описаны принципы реакций, методики их постановки,
материально — техническое обеспечение, источники получения
ошибочных результатов и мероприятия по технике безопасности при
работе с инфекционным материалом.
Организация — разработчик: ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ.
Авторы: докт. биол. наук, проф. Г.А.Дмитриев, докт. мед. наук,
проф. В.Н.Беднова, докт. мед. наук Г.Ф.Тимченко, канд. мед. наук
Г.А.Киселева, канд. мед. наук Т.И.Милонова, канд. мед. наук
Для серо- и ликвородиагностики сифилиса в России могут
применяться следующие методы:
1. Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР),
которая является отборочным тестом при обследовании населения на
сифилис. Постановка МР осуществляется с плазмой или
инактивированной сывороткой крови. Зарубежные тесты ВДРЛ (VDRL),
РПР (RPR) и другие аналогичные МР как по принципу постановки
реакции, так и по чувствительности и специфичности.
2. Иммуноферментный анализ (ИФА). Антиген из культуральных или
патогенных бледных трепонем.
3. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Антиген из
культуральных или патогенных бледных трепонем.
4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях:
РИФ-абс, РИФ-ц, РИФ с капиллярной кровью из пальца. Антиген —
патогенная бледная трепонема штамма Никольса.
5. Комплекс серологических реакций на сифилис (КСР), состоящий
из реакции связывания комплемента (РСК) с трепонемным и
кардиолипиновым антигенами, и МР. Поскольку трепонемный антиген
является специфическим, КСР относится к диагностическим тестам. В
связи с разработкой более чувствительных, специфичных и менее
трудоемких реакций стало возможным заменить при постановке КСР
реакцию связывания комплемента на ИФА или РПГА также в сочетании с
6. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), в которой в
качестве антигена используют патогенные бледные трепонемы штамма
РИТ, РИФ, ИФА и РПГА являются высокочувствительными и
высокоспецифичными реакциями на сифилис. Они относятся к
диагностическим подтверждающим тестам. При этом в связи с
простотой постановки и наличием коммерческих тест — систем ИФА и
РПГА могут быть и высокоэффективными отборочными тестами.
Ввиду различной чувствительности при разных формах сифилиса,
специфичности и сложности постановки каждая из указанных реакций
имеет свое предназначение.
Профилактическое обследование населения на сифилис можно
проводить с помощью МР, КСР, ИФА и РПГА. Все организационные
вопросы по применению данных реакций с этой целью решаются
органами здравоохранения на местах в зависимости от местных
При получении положительного результата в МР пациент должен
обследоваться дерматовенерологом с повторным исследованием крови в
любом диагностическом тесте на сифилис.
При профилактическом обследовании на сифилис больных глазных,
психоневрологических, кардиологических стационаров, беременных, в
частности, направляемых на искусственное прерывание беременности,
должны использоваться КСР, ИФА или РПГА.
При обследовании доноров необходимо применять КСР или ИФА или
РПГА, но обязательно в сочетании с МР. Постановка двух реакций
одновременно обусловлена высокой ответственностью данного
МР в количественном варианте с экономической точки зрения
необходимо использовать в качестве контроля эффективности лечения,
заменив ею количественную постановку РСК с кардиолипиновым
Вышеуказанные специфические тесты служат для диагностики всех
форм сифилиса, в частности, скрытого, а также для распознавания
ложноположительных результатов, полученных в МР и КСР. При
диагностике скрытого сифилиса целесообразна постановка двух
специфических тестов одновременно.
Поскольку ИФА и РПГА являются более высокочувствительными,
специфическими и воспроизводимыми тест — системами, которые можно
использовать в качестве отборочных и подтверждающих тестов,
осуществить до 2006 г. замену комплекса серореакций (КСР)
вышеуказанными реакциями при диагностике сифилиса.
Таким образом, последовательность обследования пациентов на
сифилис представляется следующим образом:
— при первичном обследовании производится постановка
отборочной (скрининговой) реакции микропреципитации (РМП) или ее
модификации (RPR- РПР, TRUST — ТРАСТ, VDRL — ВДРЛ) в
количественном и качественном вариантах и в случае положительного
результата — любого специфического подтверждающего трепонемного
теста (РПГА, ИФА, КСР, РИФ, РИТ);
— после окончания терапии ставится РМП или ее модификация и по
снижению титра судят о динамике инфекционного процесса и
эффективности терапии. Подтверждением эффективности проведенной
терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года;
— по окончании этого срока осуществляется постановка той же
специфической реакции, что и при первичном обследовании. Следует
учитывать, что специфические трепонемные тесты могут оставаться
положительными (не негативировать) в течение ряда лет, а в
отдельных случаях остаются положительными на всю жизнь.
Методика постановки и суть различных модификаций МР, ИФА,
РПГА, РИФ, РСК и РИТ подробно описаны в настоящих Методических
Впервые детально описаны 6 методов, используемых для серо- и
ликвородиагностики сифилиса включающих 15 модификаций.
Рекомендована замена РСК при определении эффективности лечения
сифилиса МР, что дает экономический эффект. Введена в инструкцию
количественная методика постановки РИТ, расширяющая возможности
поздних форм сифилиса. Включены методики постановки РСК, РИТ,
РИФ-ц и ИФА для ликвородиагностики сифилиса.
Показания к применению метода
Серо- и ликвородиагностика всех форм сифилиса.
^ МИКРОРЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ С КАРДИОЛИПИНОВЫМ АНТИГЕНОМ
Принцип. При добавлении к плазме или сыворотке крови больного
сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат
(комплекс антиген — антитело), выпадающий в виде хлопьев белого
Материально — техническое обеспечение метода
Оборудование для взятия крови и постановки МР:
— капиллярные пипетки аппарата Панченкова;
— градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл;
— автоматические пипетки на 20-200 мкл;
— наконечники для автоматических пипеток;
— пробирки длиной 8-10 см и 14-15см, диаметром 1-1,5 см или
— пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2
см, глубиной не менее 0,5 см;
— иглы для взятия крови из пальца и вены; шприцы;
— центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин;
— стерилизатор для кипячения игл, шприцов, инструментов.
— антиген кардиолипиновый для микрореакции;
— холин — хлорид (включается в упаковку с антигеном);
— натрий лимоннокислый (цитрат натрия)трехзамещенный
— изотонический раствор натрия хлорида 0,9%;
— 10% раствор холин — хлорида готовится следующим
образом: к 29,65 мл изотонического раствора натрия
хлорида добавляют 0,35 мл 0,01% раствора мертиолата
и 5 мл 70% раствора холин — хлорида. Смесь тщательно
перемешивают. При отсутствии мертиолата для
приготовления 10% раствора холин — хлорида
необходимо к 30 мл стерильного изотонического
раствора натрия хлорида добавить 5 мл 70% раствора
— 5% раствор трехзамещенного цитрата натрия
готовится на дистиллированной воде и фильтруется.
Раствор не стоек. При помутнении его надо заменять
свежим. Хранится в холодильнике при 4 град. в
Контрольные лиофилизированные сыворотки крови необходимы для
установления пригодности эмульсии антигена. Отрицательную и
положительную контрольные сыворотки крови используют
неразведенными, слабоположительную получают из положительной путем
ее разведения по титру, установленному в день приготовления
эмульсии антигена. При отсутствии лиофилизированных сывороток
крови используют нативную положительную или смесь положительных в
РСК с кардиолипиновым антигеном или микрореакции инактивированных
сывороток крови, которые разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно
закрывающимися пробками, хранят в морозильном отделении
холодильника, используют с титром выше 1:8. В день постановки
реакции сыворотку крови титруют на пластинке с целью подтверждения
ранее установленного титра, для контроля качества эмульсии и
получения слабоположительного результата, который используют затем
Титрование контрольной сыворотки проводят следующим образом: в
9 лунок пластинки, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл
изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и
вторую лунки по 90 мкл контрольной сыворотки крови. Содержимое
второй лунки перемешивают пипеткой, насасывая и выпуская его в
лунку 5-6 раз. Затем набирают 90 мкл содержимого второй лунки в
пипетку и 90 мкл переносят в третью лунку. Содержимое третьей
лунки перемешивают таким же образом и переносят в четвертую лунку
и так далее до последней лунки. Из последней лунки 90 мкл удаляют.
Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового
антигена. Пластинку встряхивают в аппарате в течение 5 минут,
добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и
оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после чего
регистрируют результаты. Разведение сыворотки крови, давшее
слабоположительный результат (+/ 2+), используют в качестве
слабоположительного контроля. Для получения его делают
соответствующее разведение. Например, если слабоположительный
результат получен с разведением сыворотки крови 1:8, то для
получения контрольной слабоположительной сыворотки крови в
пробирку вносят 0,7 мл изотонического раствора натрия хлорида и
0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.
При правильно проведенном титровании положительной сыворотки
крови по мере ее разведения наблюдается равномерное уменьшение
величины хлопьев преципитата.
При снижении реактивности хранящейся нативной контрольной
сыворотки крови используют разведение, дающее слабоположительный
результат при повторном титровании. Контрольную сыворотку крови
можно использовать до тех пор, пока она дает положительный
результат (4+) в разведении не ниже 1:2, и слабоположительный
результат (2+) в разведении не меньше 1:4. При дальнейшем снижении
реактивности употреблявшуюся положительную контрольную сыворотку
При хранении контрольных сывороток крови не допускаются
повторные замораживания их и оттаивание, т.к. в этом случае
реактивность их снижается.
О снижении реактивности контрольной сыворотки крови, а не
эмульсии антигена, судят по параллельному титрованию этой
сыворотки крови с использованием хранившейся и вновь
приготовленной эмульсии. Если получают один и тот же титр антител
в МР с обеими антигенными эмульсиями, то считают, что снижение
реактивности зависит от хранения контрольной сыворотки крови, если
же снижение реактивности наблюдают только при использовании
хранившейся эмульсии антигена, то это обусловлено снижением
реактивности эмульсии антигена, которую необходимо заменить
Серологические лаборатории кожно — венерологических
диспансеров должны снабжать контрольными сыворотками крови
лаборатории района, использующие в своей работе экспресс — метод и
не имеющие положительных и отрицательных сывороток крови. При
отсутствии контрольных сывороток крови реакцию ставить нельзя.
Эмульсия кардиолипинового антигена готовится из специального
кардиолипинового антигена для микрореакции преципитации. Нельзя
использовать в микрореакции кардиолипиновый антиген,
предназначенный для реакции связывания комплемента.
Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на
прозрачность ампулированного антигена. При выпадении кристаллов
холестерина их растворяют нагреванием ампул в термостате или
водяной бане при 37 град. С или 56 град. С соответственно.
Прежде чем приготовить эмульсию, рассчитывают необходимое
количество ее на рабочий день или рабочую неделю (на 50
исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена). В пробирку
вносят сухой пипеткой не более 2 мл антигена, добавляя его к
равному объему 0,9% изотонического раствора натрия хлорида,
перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 минут,
затем центрифугируют при 1000 об/мин до получения прозрачной
жидкости, которую удаляют, а к осадку добавляют 3,5 объема (по
отношению к взятому антигену) 10% раствора холин — хлорида.
Например, если требуемый объем антигена равен 0,5 мл, то для
вычисления количества холин — хлорида 0,5 мл умножают на 3,5 и
получают 1,75 мл, т.е. необходимый объем холин — хлорида. Пробирку
плотно закрывают пробкой и содержимое перемешивают, опрокидывая
пробирку, до полного ресуспендирования. Полученная эмульсия готова
к употреблению. При необходимости приготовления большого
количества эмульсии, ее готовят не в одном флаконе большой
емкости, а в нескольких пробирках, внося в каждую из них по 2 мл
антигена. Такие объемы обеспечивают лучшее перемешивание антигена,
предохраняют его от загрязнений при повторном взятии для
постановки реакции, а также от нагревания и действия солнечных
Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4 град. не более
недели, а при добавлении раствора мертиолата — в течение 2 недель.
В день постановки реакции нужное для данного рабочего дня
количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для
согревания при комнатной температуре на 30 минут и перемешивают
ее, опрокидывая пробирку, закрытую пробкой, не менее 30 раз, затем
проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови.
Применяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув
пробирки с ней черной бумагой. Пригодность каждой новой серии
антигена проверяют в экспресс — методе одновременно с уже бывшей в
работе серией на заведомо положительных и отрицательных сыворотках
крови. О пригодности антигена судят по величине титров,
наблюдаемых при одновременном титровании положительных сывороток
крови с новой и проверенной сериями антигенов. Получение близких
результатов, т.е. величин титров реагентов, отличающихся на +/-1
разведение, одинаковой выраженности хлопьев преципитата,
наблюдаемых в одних и тех же разведениях положительных сывороток
крови свидетельствует о пригодности исследуемой серии антигена.
Серию антигена бракуют, если одновременное титрование контрольной
положительной сыворотки крови с новой серией антигена показывает:
а)слабо выраженный преципитат (2+/1+) при минимальных разведениях
сыворотки крови; б) более низкий (на 2-3 разведения) титр
реагинов, чем с употреблявшейся проверенной серией; в) наличие
преципитата в отрицательных сыворотках крови.
Кровь берут из пальца так же, как для исследования скорости
оседания эритроцитов (СОЭ). При взятии крови смачивают капилляр
аппарата Панченкова 5% раствором цитрата натрия, набрав раствор до
метки «25», а оставшийся цитрат натрия выливают в центрифужную
пробирку, куда затем вносят три капилляра крови, взятой до метки
«К», перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а в
экстренных случаях центрифугируют с целью получения плазмы крови,
которую отсасывают автоматической пипеткой для проведения
Получение инактивированной сыворотки крови:
Кровь берут из вены, получают сыворотку крови и инактивируют
Методика постановки микрореакции:
Качественную и количественную постановки микрореакции с
испытуемой плазмой и инактивированной сывороткой крови следует
осуществлять следующим образом.
При использовании качественной методики постановки
микрореакции автоматической пипеткой забирают по 90 мкл плазмы или
инактивированной сыворотки крови и вносят в лунки, куда затем
добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. В каждую
лунку вносят плазму или сыворотку крови от одного обследуемого и
нумеруют соответственно списку в регистрационном журнале.
Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины во встряхивателе
(100 качаний в 1 минуту) в течение 5 минут, затем в каждую лунку
добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида,
перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной
температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции
23-28 град.). Результаты учитывают только после появления хлопьев
в контрольной слабоположительной сыворотке крови.
При использовании количественной методики постановки
микрореакции в 9 лунок горизонтального ряда пластины, начиная со
второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия
хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл исследуемой
плазмы или сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают
автоматической пипеткой, забирая его и выпуская из нее в лунку 5-6
раз, затем забирают 90 мкл и переносят в третью лунку. Из третьей
лунки 90 мкл переносят в четвертую и т. д. по десятую лунку, из
которой 90 мкл удаляют. Таким образом получают двукратные
разведения плазмы или сыворотки крови 1:2, 1:4, 1:8 и далее до
1:516. В первую лунку изотонический раствор натрия хлорида не
приливают, а вносят только 90 мкл плазмы или сыворотки крови, т.е.
исследуют цельную плазму или сыворотку крови. Во все лунки
добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластину
встряхивают 5 минут, после чего во все лунки добавляют по 90 мкл
изотонического раствора натрия хлорида. Через 5 минут регистрируют
результаты так же, как при постановке качественной реакции.
Титром преципитинов считают последнее разведение плазмы или
сыворотки крови, где обнаружен преципитат. Величина титра
указывает на активность процесса, а его снижение во время
лечения — на эффективность терапии. Стабильность титров
настораживает клиницистов в отношении эффективности терапии,
увеличение же их требует пересмотра лечения.
Для получения достоверных результатов следует пользоваться
одной и той же серией препарата при обследовании больного в
процессе лечения, что относится ко всем реакциям на сифилис.
К моменту снятия леченного больного с учета неспецифические
тесты с кардиолипиновым антигеном обычно негативируются, в то
время как позитивность специфических реакций может наблюдаться
долго после окончания лечения, в связи с чем эти тесты не могут
служить критерием излеченности и больные снимаются с учета с
положительными результатами РИТ, РИФ, ИФА, РПГА.
Источники ошибок при постановке МР:
— неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха
— исключение из постановки реакции контрольных сывороток
крови, в частности, слабоположительных;
— неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие
недостаточного перемешивания ее перед использованием;
— бактериальное загрязнение эмульсии;
— нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки
крови, антигена и его эмульсии, растворов;
— замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным;
— использование при постановке реакций загрязненных пробирок,
пипеток, пластинок, растворов.
Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как
ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов реакции.
^ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ СЕРО- И ЛИКВОРОДИАГНОСТИКИ
Принцип иммуноферментного анализа заключается в соединении
комплекса «антиген — антитело» с конъюгатом, содержащим ферментную
метку, выявляемую с помощью субстратной смеси. В настоящее время в
нашей стране ИФА тест — системы разрабатываются по трем схемам
В основе первой схемы лежит следующее:
На твердофазном носителе (чаще лунки полистиролового планшета)
зафиксирован антиген возбудителя сифилиса, который инкубируется с
испытуемой сывороткой, плазмой крови или ликвором. При наличии в
этом материале от пациентов противотрепонемных антител происходит
их связывание в комплекс «антиген — антитело» (I фаза реакции).
После удаления не связавшихся иммуноглобулинов следует инкубация с
мечеными ферментом антителами к антивидовым иммуноглобулинам
(конъюгат), в ходе которой на поверхности носителя происходит
присоединение к имеющимся комплексам «антиген — антитело» антител,
меченных ферментом (II фаза). После удаления не связавшегося
конъюгата в ходе инкубации с раствором субстрата (в случае
использования пероксидазного конъюгата, это перекись водорода в
сочетании с орто — фенилендиамином (ОФД), 5-аминосалициловой
кислотой (5-АСК) или тетраметилбензидином (ТМБ)) происходит
взаимодействие фермента с субстратом, в результате чего
развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от
количества связанных сывороточных антител (III фаза). Результат
реакции оценивается спектрофотометрически с выводом цифровых
данных, что исключает субъективность оценки, или визуально, что
может быть полезным при отсутствии в лабораториях соответствующего
оборудования. По такому принципу в настоящее время построено
большинство ИФА тест — систем для диагностики сифилиса.
Вторая схема — ИФА с фиксированными антителами или «ловушка
для антител». Здесь на твердофазном носителе фиксируются
аффинноочищенные антитела против определенного класса
иммуноглобулинов (М, G или А), которые связывают находящиеся в
испытуемых сыворотках крови иммуноглобулины соответствующего
класса (I фаза реакции). Образование комплекса «антитело —
специфический иммуноглобулин» выявляют с помощью конъюгата,
состоящего из антигенов бледной трепонемы, меченных ферментом (II
фаза). При инкубации с субстратом (III фаза) в случае наличия
сифилитических антител в испытуемой сыворотке или плазме крови
наступает окрашивание раствора. В нашей стране разрабатываются
подобные тест — системы, в основном для выявления
Третья схема ИФА используется для выявления суммарных антител,
специфических для определенного антигена, независимо от их класса.
Ее суть заключается в том, что специфические сывороточные антитела
одновременно взаимодействуют с антигеном, зафиксированным на
твердофазном носителе, и с тем же антигеном, меченным ферментом,
при совместной инкубации испытуемого образца и конъюгата (I фаза
реакции). Наличие образовавшегося комплекса определяют с помощью
В зависимости от используемых антигенов все ИФА тест — системы
для выявления антител подразделяются на:
1) лизатные (лизированный или обработанный ультразвуком
возбудитель инфекции, полученный в культуре);
2) рекомбинантные — используются полученные генно — инженерным
способом белки — аналоги определенных белковых антигенов
3) пептидные — использующие синтетические фрагменты белков.
Среди отечественных ИФА тест — систем для выявления
сифилитических антител, уже рекомендованных Министерством
здравоохранения РФ к применению в медицинской практике, имеются
лизатные, рекомбинантные и пептидные.
1. Тест — система иммуноферментная для выявления антител к
Treponema pallidum в сыворотке или плазме крови человека
«РекомбиБест антипаллидум» и «РекомбиБест антипаллидум — стрип».
Разработчик — ЗАО «Вектор — Бест», п. Кольцово Новосибирской
области. Назначение — выявление специфических IgG.
2. Тест — система иммуноферментная для выявления антител к
Treponema pallidum в сыворотке или плазме крови человека
«РекомбиБест антипаллидум — суммарные антитела». Разработчик — ЗАО
По материалам medznate.ru