Комплекс серологических реакций для диагностики сифилиса


Серологические реакции позволяют выявлять иммунные сдвиги в организме боль ного в ответ на размножение в нем возбудителя болезни.

Антигенное строение бледной трепонемы. Наиболее изучены следующие антигены:

1) протеиновые антигены бледной трепонемы; имеют в своем составе фракцию, общую для патогенных трепонем и сапрофитных трепонем, против которой синтезируются групповые антитела; кроме того, имеется фракция, специфичная только для пато генных трепонем; протеиновые антигены бледной трепонемы высокоиммуногенны, антитела против них появляются в организме в конце инкубацион ного периода или в течение первой недели после по явления твердого шанкра;

2) антигены полисахаридной природы; мало иммуно генны, так как антитела против них не достигают значительных титров, поэтому роль этих антител в серодиагностике сифилиса незначительна;

3) липидные антигены бледной трепонемы; составля ют около 30% сухой массы клетки; помимо липидов бледной трепонемы, в организме больного появля ется большое количество веществ липидной приро ды в результате разрушения клеток тканей, в основ ном, липидов митохондриальных мембран; по видимому, они имеют такое же строение, как и липидные антигены бледной трепонемы и обладают свойствами аутоантигенов; антитела в организ ме больного появляются примерно на 5–6 й неделе после заражения.

В иммунном ответе организма принимают участие как клеточные (макрофаги, Т лимфоциты), так и гумораль ные механизмы (синтез специфических иммуноглобули нов). Появление противосифилитических антител про исходит в соответствии с общими закономерностями иммунного ответа: вначале вырабатываются IgM, по мере развития болезни начинает преобладать синтез IgG; IgA вырабатываются в сравнительно небольших количествах.

Вопрос о синтезе IgE и IgD в настоящее время изучен недостаточно. IgM появляются на 2–4 й неделе после за ражения и исчезают у нелеченных больных примерно че рез 18 мес; при лечении раннего сифилиса — через 3–6 мес, позднего — через 1 год. IgG появляются обычно на 4 й не деле после заражения и достигают, как правило, более вы соких титров, чем IgM. Антитела этого класса могут дли тельно сохраняться даже после клинического излечения больного.

Сифилитические антитела могут быть неспецифическими (реагины) и специфическими (противотрепонем ными). Реагины направлены против липидных антигенов бледной трепонемы и против аутоантигенов, возникаю щих вследствие деструкции клеток организма. Следует иметь в виду, что реагины обнаруживаются также в нор мальных тканях, и их количество повышается при раз личных физиологических и патологических состояниях. Эти реагины могут быть причиной так называемых био логических ложноположительных серологических реак ций на сифилис.

Специфические антитрепонемные антитела, относящиеся к IgM и IgG, направлены против бледной трепоне мы и так же как и антигены трепонемы могут быть груп поспецифичными и видоспецифичными.

Для определения антител в сыворотке крови больного используют различные серологические реакции, отли чающиеся друг от друга чувствительностью, специфич ностью, сложностью постановки и стоимостью. Учиты вая, что все серологические реакции на сифилис в опреде ленных условиях могут быть ложноположительными, их следует ставить в комплексе и, при необходимости, в ди намике.

Серологические реакции, в зависимости от выявляемых ими антител, подразделяются на три группы:

I. Липидные (реагиновые) реакции:

1) микрореакции на стекле с липидными антигенами — экспресс метод диагностики (микрореакции преципитации — МРП, VDRL, CMF, RPR и др.);

2) реакция связывания комплемента (РСК) с липидными антигенами — реакция Вассермана;

3) осадочные реакции (реакция преципитации Кана, цитохолевая реакция Закса — Витебского и др.).

II. Групповые трепонемные реакции:

1) РСК с протеиновым антигеном Рейтера;

2) реакция иммунофлюоресценции (РИФ);

3) реакция иммунного прилипания (РИП).

III. Видоспецифичные протеиновые трепонемные реакции:

1) реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ);

2) РИФ Абс.и ее варианты (IgM FTA ABS, 19S IgM FTA ABS, и др.);

3) реакция непрямой гемагглютинации бледных трепонем (РПГА).

Различные серологические реакции используются для разных практических целей. За рубежом при массовых обследованиях населения и при необходимости экстренного выявления сифилиса используются отборочные ре акции (VDRL и др.). Для диагностики (подтверждения) сифилиса применяют РСК с кардиолипиновым и трепо немным антигенами и РИФ Абс. С целью контроля за эф фективностью терапии рекомендуют VDRL в количест венном исполнении, 19S IgM FTA ABS, и в качестве реакции экспертизы в случаях расхождения трепонем ных реакций применяют РИТ. При отрицательных ре зультатах РИТ и 19S IgM FTA ABS считается, что об следуемый не страдает сифилисом.

В отечественной практике используют комплекс серологических реакций, включающий:

1) отборочные реакции микропреципитации (МРП)с кардиолипиновым антигеном;

2) стандартные серологические реакции — РСК с кардиолипиновым и трепонемным антигенами;

3) РИФ и ее модификацию РИФ Абс.;

Отборочные серологические реакции на сифилис или микрореакции на стекле для экспресс?диаг? ностики

Эти реакции используются для массовых серологических обследований на сифилис (лиц декретированных профессий, больных соматических стационаров, пациен тов поликлиник и амбулаторий); для экспресс диагности ки в кожно венерологических диспансерах. Их не приме няют для обследования беременных и доноров, а также для контроля после излечения больных сифилисом.

Микрореакции можно ставить в обычных клинических лабораториях.

Постановка микрореакций осуществляется на стекле с каплей крови, плазмы, активированной или неактивиро ванной сывороткой и специальным кардиолипиновым антигеном. Кардиолипиновый антиген отличается высо кой чувствительностью и представляет собой экстракт

бычьего сердца, обогащенный холестерином и лецити ном. МРП можно проводить по количественной методике с разведением сыворотки крови. Существует несколько вариантов микрореакций (VDRL, RPR, USR, ART), отли чающихся друг от друга в основном применяемым анти геном. В нашей стране используют микрореакции преци питации (МРП).

Преимуществом экспресс метода являются быстрота получения ответа (через 30–40 мин), небольшой объем необходимой для анализа крови (2–3 капли плазмы или сыворотки). МРП могут давать ложноположительные, а в отдельных случаях и отрицательные результаты при ак тивных формах сифилиса, поэтому окончательный диаг ноз этим методом устанавливать запрещено. У больных вторичным сифилисом (в 1% случаев) микрореакции, в частности, VDRL, могут быть отрицательными при по становке с цельной сывороткой и положительными при ее разведении (феномен прозоны, «prozoon phenome non»).

В качестве отборочных реакций рекомендуют также применять реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА). Наивысшую чувствительность этого теста отмечают у не леченных (100%) и леченных (99,6%) больных как с ран ними, так и поздними формами сифилиса. При контроле результатов лечения тест не имеет значения, так как дает отрицательные результаты в малом количестве случаев. Возможность использовать антиген Рейтера, простота, высокая чувствительность, малая стоимость ставят РПГА на первое место среди методов для диагностики сифили са. Ценность ее еще более повышается при автоматиче ском выполнении.

Диагностические подтверждающие серологические реакции при сифилисе

Стандартные серологические реакции.

Реакция Вассермана (РВ). Разработана А. Вассерманом совместно с А. Нейссером и Бруком в 1906 г. Исторически это первый серологический метод диагностики си филиса. Реакция основана на феномене связывания комплемента (реакция Борде — Жангу) и определяет противолипидные антитела (реагины) — классическая реакция. В настоящее время реакцию связывания ком плимента ставят еще со специфическими трепонемными антигенами (неклассическая реакция).

Липидные антигены, используемые в РВ, являются неполноценными антигенами — гаптенами. Они не обла дают иммунногенной способностью. После специальной обработки эти гаптены приобретают свойства полноцен ных антигенов. Антигены, приготовленные из культу ральных и патогенных трепонем, представляют собой полноценные антигены.

В РВ используют одновременно два антигена: кардиолипиновый и трепонемный. Трепонемный антиген пред ставляет собой обработанную ультразвуком взвесь апато генных культуральных трепонем. Эти антигены образуют совместно с реагинами сыворотки крови больного им мунный комплекс, способный адсорбировать, связывать комплемент. Поскольку образовавшийся комплекс (реа гины + антиген + комплемент) невидим, для определения наступившего связывания комплемента необходима как индикатор гемолитическая система (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой).

Если комплемент связан в первой фазе реакции (реагины + антиген + комплемент), то гемолиз не наступит, эритроциты выпадут в осадок, легко заметный невоору женным глазом (РВ положительная).

Если в первой фазе комплемент связан не будет вследствие отсутствия в испытуемой сыворотке реагинов, то он используется гемолитической системой и произойдет ге молиз (РВ отрицательная). Степень выраженности гемо лиза в реакции Вассермана оценивается плюсами: полное отсутствие гемолиза 4+ (РВ резко положительная), едва начавшийся гемолиз 3+ (РВ положительная), значительный гемолиз 2+ (РВ слабоположительная), полный гемо

Кроме качественной оценки РВ, имеется количественная постановка ее с различными разведениямии сыворот ки крови (1 : 10, 1 : 20, 1 : 80, 1 : 160, 1 : 320). Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный (4+) результат. Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых форм сифилиса и при контроле за успешностью терапии.

Реакция Вассермана обладает недостаточной чувствительностью. Она отрицательна в начале первичной стадии, бывает негативной у 1/больных третичным активным сифилисом с поражениями кожи, слизистых оболочек, кос тей, внутренних органов, центральной нервной системы, поздним врожденным сифилисом, особенно если больные в прошлом подвергались лечению антибиотиками.

В первичном периоде сифилиса РВ становится положительной через 2–3 нед после появления твердого шан кра или на 5–6 й неделе после заражения, во вторичном — почти у 100% больных, в третичном активном — 70–75%, при спинной сухотке — у 50%, прогрессивном параличе — 95–98%.

После окончания специфического лечения первичного серопозитивного и вторичного свежего сифилиса реак ция становится отрицательной в сроки от 1,5 до 7–8 мес. При поздних формах сифилиса она может на долгие годы оставаться положительной несмотря на дополнительное лечение (серорезистентность). Для увеличения чувстви тельности РВ ставят на холоду.

Осадочные реакции (Кана, Закс — Витебского, Мейника) за рубежом в течение длительного ввремени явля лись основными для диагностики сифилиса. В нашей стране они обязательно дополняли РВ. Иммунологиче ская сущность осадочных реакций ничем не отличается от РВ, но для них готовят более концентрированные ан тигены, которые при взаимодействии с реагинами дают видимый глазом осадок, оцениваемый качественно. В на

стоящее время эти реакции не используются.

Все реагиновые серологические реакции не являются строго специфичными и могут давать ложноположитель ные результаты.

Ложноположительные серологические реакции на сифилис. Ложноположительными (неспецифическими, биологически ложноположительными) называются по ложительные серологические реакции на сифилис у лю дей, которые никогда не болели и в момент обследования не болеют сифилисом.

В случаях ложноположительных серологических реакций в сыворотке крови обследуемых людей имеются только реагины, но отсутствуют иммобилизины, компле ментсвязывающие протеиновые антитела и антитела, оп ределяемые в РИФ.

Н. М. Овчинников (1987) выделяет три группы основных причин ложноположительных реагиновых серологических реакций на сифилис:

1) инфекционные заболевания, возбудители которых имеют антигенное сходство с бледной трепонемой (возвратный тиф, фрамбезия, беджель, пинта, леп тостероз; воспалительные процессы, обусловлен ные трепонемами, сапрофитирующими в полости рта и на половых органах);

2) физиологические и патологические состояния, приводящие к изменению обмена веществ, особен но липидного (беременность, подагра, сыпной тиф, малярия, пневмония, лепра, эндокардит, диффуз ные болезни соединительной ткани, инфаркт мио карда, сотрясение мозга, искусственная иммуниза ция, онкологические заболевания; отравление свинцом, фосфором, хлороформом; прием салици лата натрия, дигиталиса и пр.);

3) технические погрешности при постановке реакций.

Различают острые и хронические ложноположительные реакции. Острые ложноположительные реакции не стойки и их спонтанная негативация происходит в течение

4–6 мес. Хронические реакции сохраняются положительными более 6 мес.

Причинами острых биологически ложноположитель ных реакций являются беременность (особенно в послед ние недели ее и первые 10 дней после родов); воспаление легких, в частности, микоплазменной этиологии; корь, энтеровирусная инфекция, инфекционный мононуклеоз, вакцинация, наркомания, алкоголизм. Реже они наблю даются при активном туберкулезе, скарлатине, вирусной пневмонии, бруцеллезе, риккетсиозах, лептоспирозе, кори, венерической лимфогранулеме, малярии, белковом голодании. У больных, прекративших принимать нарко тики, ложноположительные серологические реакции на сифилис сохраняются до 14 мес. Иногда причинами не специфических серологических реакций бывают обшир ные травмы, сотрясение головного мозга, переломы, ин фаркт миокарда, а также технические погрешности при постановке реакций.

Хронические ложноположительные стандартные серологические реакции могут наблюдаться у больных лепрой, системной красной волчанкой, тиреоидитом Хашимото, ревматизмом, узелковым периартериитом, циррозом пе чени, саркоидозом, генерализованной склеродермией, криоглобулиновой пурпурой, злокачественными опухо лями, малярией, туберкулезом, бруцеллезом, лептоспи розом, инфекционным мононуклеозом, сахарным диабе том, болезнями крови, гипертонической болезнью, хроническим алкоголизмом и наркоманией. С возрастом количество ложноположительных результатов увеличи вается. У женщин они наблюдаются в 4,5 раза чаще, чем у мужчин. Иногда причины ложноположительных реак ций остаются неясными (идиопатические реакции) или они наблюдаются спонтанно в некоторых семьях.

Неспецифические серологические реакции составляют в среднем 0,03–2,5%. Чаще они бывают слабоположи тельными, а если положительными, то с низким титром сифилитических реагинов. При некоторых заболеваниях (лимфомах, хроническом лимфолейкозе, ревматоидном артрите, раке печени) титр их, однако, может быть высо ким. При повторном исследовании неспецифические ре акции становятся отрицательными или выраженность их снижается, в то время как титр сывороток больных сифи лисом остается таким же или нарастает.

При неспецифических результатах наблюдаются расхождения РВ и осадочных реакций. Иногда отмечается несовпадение результатов реакций при постановке ее с разными антигенами: с одним антигеном получают поло жительные результаты, с другим — отрицательные. В слу чае резкого расхождения исследования надо повторить с новой порцией крови, но не раньше, чем через неделю. Наиболее достоверным критерием истинно сифилитиче ских показаний классических серологических реакций является результат, полученный при исследовании крови с помощью РИТ, хотя она иногда также дает ложнополо жительные и ложноотрицательные результаты.

В подобных случаях следует использовать серологические реакции, позволяющие обнаружить антитела класса IgM, являющиеся наиболее специфическими для сифи лиса (IgM FTA ABS, IgM FTA 19S).

Группа специфических серологических реакций

Существует пять основных типов специфических реакций, в которых используется трепонемный антиген. Они отличаются друг от друга методами определения комплексов антиген — антитело: иммунофлюоресценция, иммобилизация, иммуноферментный анализ, гемагглю цинация, фиксация комплемента.

1. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) занимает центральное положение среди специфических реакций.

Принцип ее заключается в том, что исследуемой сыворот кой обрабатывается антиген, который представляет со бой бледная трепонема штамма Никольса, полученный из орхита кролика, высушенный на предметном стекле и за фиксированный ацетоном.

После промывания препарат обрабатывается люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека. Флюоресцирующий комплекс (античеловеческий глобу лин + флюоресцеин тиоизоционат) связывается с челове ческим глобулином на поверхности бледной трепонемы и может быть идентифицирован методом люминесцентной микроскопии.

Для серодиагностики сифилиса используется несколько модификаций РИФ:

а) реакция иммунофлюоресценции с абсорбцией (РИФ6Абс.). Групповые антитела удаляются из исследуе мой сыворотки с помощью разрушенных ультразвуком культуральных трепонем, что резко повышает специфич ность реакции. Поскольку исследуемая сыворотка разво дится только 1:5, то модификация сохраняет высокую чувствительность. По чувствительности и специфично сти РИФ Абс. не уступает реакции Нельсона (РИТ) и на много проще последней в постановке. РИФ Абс. стано вится положительной в начале 3 й недели после заражения (до появления твердого шанкра или одновре менно с ним) и является методом ранней серодиагности ки сифилиса.

Нередко сыворотка остается положитель ной и спустя несколько лет после полноценного лечения раннего сифилиса, а у больных с поздним сифилисом — на протяжении десятилетий.

Показания для постановки РИФ Абс.:

— положительная реакция Вассермана у беременных при отсутствии клинических и анамнестических данных в пользу сифилиса;

— положительная реакция Вассермана у лиц с различными соматическими и инфекционными заболеваниями;

— отрицательная реакция Вассермана у лиц с клиниче скими проявлениями сифилиса (метод ранней диагно стики сифилиса).

Переход положительной РИФ Абс. в отрицательную, в результате проведенного лечения, является аболютным критерием успешности противосифилитического лече ния.

Ложноположительные результаты РИФ Абс. отмеча ли у беременных, алкоголиков, больных с ревматоидным артритом, системной и дискоидной красной волчанкой, склеродермией, смешанной болезнью соединительной ткани, циррозом печени. Иногда реакция бывает положи тельной у здоровых людей. Кроме того, могут быть техни ческие ошибки;

б) реакция IgM6РИФ6Абс. Выше указано, что у боль ных с ранним сифилисом в первые недели болезни по являются IgM, которые в данный период являются но сителями специфических свойств сыворотки. В более поздние сроки болезни начинают преобладать IgG. Этот же класс иммуноглобулинов ответственен и за ложнопо ложительные результаты, так как групповые антитела бывают результатом длительной по времени иммуниза ции сапрофитными трепонемами (полости рта, половых органов и др.).

Раздельное изучение классов Ig представляет особый интерес при серодиагностике врожденного сифилиса, где противотрепонемные антитела, синтезированные в орга низме ребенка, будут представлены IgM, а IgG будут ма теринского происхождения. Реакция IgM РИФ Абс. ос нована на использовании во второй фазе коньюгата анти IgM, вместо античеловеческого флюоресцирующе го глобулина.

Показания для постановки этой реакции:

— серодиагностика врожденного сифилиса, так как реак ция позволяет исключить IgG материнского происхож дения, которые проходят через плаценту и могут обу словить ложноположительный результат РИФ Абс., при отсутствии у ребенка активного сифилиса;

— дифференцировка реинфекции (повторного зараже ния) от рецидива сифилиса, при котором будет положи тельной РИФ Абс., но отрицательной IgM РИФ Абс.;

— оценка результатов лечения раннего сифилиса: при полноценном лечении IgM РИФ Абс. из положитель ной переходит в отрицательную. При постановке этой реакции в редких случаях могут наблюдаться ложнопо ложительные и ложноотрицательные результаты;

в) реакция 19SIgM6РИФ6Абс. В основе этой модифика ции РИФ лежит предварительное разделение более круп ных молекул 19SIgM от более мелких молекул 7SIgG ис следуемой сыворотки. Это разделение может быть произведено с помощью гель фильтрации. Исследование в реакции РИФ Абс. сыворотки, содержащей только фракцию 19SIgM, устраняет все возможные источники ошибок. Однако техника постановки реакции (особенно фракционирование исследуемой сыворотки) сложная и трудоемкая, что серьезно ограничивает возможность ее практического использования.

2. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ). Это первая из специфических реакций, предложенная для серодиагностики сифилиса. Принцип реакции за ключается в том, что при смешивании сыворотки больно го со взвесью живых патогенных бледных трепонем в присутствии комплемента утрачивается подвижность бледных трепонем, в то время как при смешивании взвеси бледных трепонем с сывороткой здоровых, подвижность бледных трепонем сохраняется длительное время. Выявляемые в этой реакции антитела иммобилизины относят ся к поздним антителам; они появляются позже компле ментсвязывающих антител и достигают максимального титра к десятому месяцу болезни, поэтому как метод ран ней диагностики реакция непригодна. Однако при вто ричном нелеченном сифилисе реакция бывает положи тельной в 95% случаев. При третичном сифилисе РИТ дает положительные результаты от 95 до 100% случаев. При сифилисе внутренних органов, ЦНС, врожденном сифилисе доля положительных результатов РИТ при ближается к 100%. Чувствительность и специфичность РИТ примерно такие же как в РИФ Абс., за исключением диагностики раннего сифилиса. Негативация РИТ в ре зультате полноценного лечения наступает не всегда; реак ция может оставаться положительной на протяжении многих лет. Показания к постановке реакций такие же, как для РИФ Абс. Из всех специфических реакций РИТ наиболее сложная и трудоемкая реакция, поэтому за ру бежом ее используют только при обследовании в сомни тельных случаях.

Ложноположительная РИТ может наблюдаться у больных лепрой, трепонематозными заболеваниями (пинта, беджель и пр.), злокачественными заболевания ми, красной волчанкой, сердечно сосудистыми заболева ниями, пневмонией. Следует учитывать, что РИТ может оказаться ложноположительной, если в исследуемой сы воротке содержатся трепонемоцидные вещества (напри мер, пенициллины, тетрациклины, эритромицин), вызы вающие неспецифическую иммобилизацию бледных трепонем, поэтому нельзя исследовать кровь на РИТ ра нее 2 нед после окончания приема антибиотиков и других противосифилитических препаратов.

3. Иммуноферментный анализ (ИФА). Принцип метода заключается в том, что антигенами бледной трепонемы сенсибилизируется поверхность твердофазового носителя (лунки панелей из полистирола или акрила). Затем в такие лунки вносится исследуемая сыворотка. При нали чии в сыворотке антител против бледных трепонем обра зуется комплекс антиген — антитело, связанный с поверх ностью носителя. На следующем этапе в лунки наливают антивидовую (против глобулинов человека) сыворотку, меченную ферментом (пероксидазой или щелочной фос фатазой). Меченые антитела (конъюгат) взаимодейству ют с комплексом антиген — антитело, образуя новый ком плекс. Для его выявления в лунки наливают раствор субстрата (5 аминосалициловая кислота). Под действием фермента субстрат меняет цвет, что указывает на положи тельный результат реакции. По чувствительности и спе цифичности метод близок к РИФ Абс. Показания к по становке ИФА такие же, как для РИФ Абс. Разработаны макро и микроварианты ИФА. Реакция может быть ав томатизирована.

4. Реакция непрямой гемагглютинации (РПГА). Принцип реакции заключается в том, что в качестве антигена используются формалинизированные и таннизирован ные эритроциты, на которых адсорбированы антигены бледной трепонемы. При добавлении такого антигена к сыворотке больного происходит склеивание эритроци тов — гемагглютинация. Специфичность и чувствитель ность реакции выше по сравнению с другими методами обнаружения антител к бледной трепонеме при условии высокого качества антигена. Реакция становится поло жительной на 3 й неделе после заражения и остается та ковой спустя много лет после выздоровления. Число лож ноположительных и ложноотрицательных результатов невелико. Разработан микрометод этой реакции, а также автоматизированная реакция микрогемагглютинации. Аналогом этой реакции за рубежом является ТРНА (T. pallidum haemagglutination).

5. Реакция гемабсорбции в твердой фазе (IgM6SPHA) (IgM — Solid phase haemabsorption). Это новая серологическая реакция, отвечающая, видимо, всем требованиям, предъявляемым к методам серодиагностики сифилиса. Реакция высокочувствительна и специфична, технически легко выполнима, становится положительной со 2 й не дели после заражения. И хотя пока еще недостаточно фактического материала для объективной оценки ее дос тоинств и недостатков, реакция представляется весьма перспективной. Принцип ее заключается в том, что стен ки лунок полистироловой панели покрываются анти IgM против человеческой сыворотки. Затем в лунки наливает ся исследуемая сыворотка со специальным абсорбирую щим разбавителем. На третьем этапе в лунки добавляют эритроцитарный диагностикум.

В положительных случаях происходит гемагглютинация — эритроциты фиксируются на стенках лунок, в от рицательных — эритроциты оседают на дно лунок в виде диска. Реакция может быть поставлена в качественном и количественном вариантах и доступна автоматизации.

Роль серологических реакций при оценке эффективности терапии. Серологические реакции являются показа телем эффективности лечения. Их необходимо проводить перед началом, во время и после противосифилитическо го лечения. При первичном сифилисе это особенно важно для определения длительности лечения, а при вторичном и других формах сифилиса — для оценки результатов ле чения.

Многочисленными исследованиями установлены примерные сроки негативации серологических реакций у больных с различными клиническими формами сифи лиса после окончания полноценного специфического лечения. У некоторых больных, однако, несмотря на полноценное лечение, серологические реакции остаются положительными и после него. В этих случаях речь мо жет идти о серорезистентности пролеченных больных или о стойко положительных серологических реакциях.

При этом нередко употребляемое определение «сероре зистентный сифилис» следует считать неверным, так как оно заранее предполагает, что у человека, страдаю щего сифилисом, положительные серологические реак ции. Причины серорезистентности во многом остаются не ясными. По мнению Н. М. Овчинникова и Т. В. Василь ева (1987), общей причины серорезистентности не суще ствует. Также нельзя однозначно ответить, нужно ли про должать лечение таких больных. Основными причинами серорезистентности являются:

— поздно начатое и неполноценное лечение больного;

— наличие у больных сифилисом хронических сопутствующих заболеваний (туберкулез, малярия и т. п.);

— присутствие трепонем в очагах, трудно доступных для действия антибиотиков (особенно если они находятся в измененной форме или в полимембранных фагосомах);

— переход бледных трепонем в формы, трудно поддаю щиеся действию пенициллина (L формы, цисты, грану лы), а также наличие в организме больного флоры, вы рабатывающей пенициллиназу, полностью или частично нейтрализующую пенициллин; нахождение трепонем в полимембранных фагосомах клеток орга низма, что делает трепонемы недоступными для дейст вия антибиотика и антител;

— нарушения липидного обмена.

Существует также точка зрения, что серорезистент ность у лиц, получивших полноценное специфическое ле чение и не имеющих никаких признаков сифилиса, явля ется результатом аутоиммунных реакций, происходящих в организме (аутоаллергия). Возможно, что у некоторых людей серорезистентность является анамнестической следовой реакцией уже в отсутствие бледных трепонем. Таким образом, вопрос о причинах серорезистентности и необходимости продолжения лечения должен решаться индивидуально.

Техника взятия крови для серологических реакций.

Кровь для исследования на РВ, РИФ и РИТ берут из локтевой вены натощак или не ранее чем через 4 ч после приема пищи шприцем или одной иглой (самотеком). В чистую пробирку вливают 5–7 мл крови (пробирка для исследования на РИТ должна быть специально подготов лена и стерильна).

Кровь для исследования экспресс методом берут из кончика пальца, как это делают при взятии ее на СОЭ, но берут на один капилляр больше. Можно также экс пресс метод ставить с сывороткой крови, полученной венепункцией.

При необходимости проведения исследования в некоторых лабораториях можно вместо крови пересылать су хие сыворотки. Для этого на следующий день после забо ра крови сыворотку отделяют от сгустка. Затем набирают

1 мл сыворотки в шприц и выливают ее в виде двух отдельных кружков на полоску плотной писчей бумаги, вощанки или целлофана размером 6 8 см. На свободном крае бума ги надписывают фамилию, инициалы больного и дату за бора крови. Сыворотку на бумаге, защищенную от пря мых лучей солнца и пыли, оставляют до следующего дня при комнатной температуре; она засыхает в виде неболь ших кружков блестящей желтой стекловидной пленки. После этого полоски бумаги с высушенной сывороткой завертывают так, как завертывают аптечный порошок, и отсылают в лабораторию с указанием диагноза и повода для исследования.

Исследование спинномозговой жидкости. Ликворологическая диагностика имеет чрезвычайно важное зна чение для установления диагноза нейросифилиса, а так же при определении излеченности больного сифилисом. Лабораторное исследование спинномозговой жидкости

рекомендуется производить перед снятием с учета после соответствующего клинико лабораторного контроля. Следует иметь в виду, что в ряде случаев патологическая спинномозговая жидкость возможна при отрицательных стандартных серологических реакциях.

Нормальная спинномозговая жидкость бесцветная, прозрачная, при хранении не образует осадка, относи тельная плотность ее 1006–1007; рН 7,35–7,4; содержание белка от 10 до 25 мг%;в1 мл нормального ликвора может содержаться от 0 до 3–5–7 форменных элементов.

Для определения специфических сифилитических изменений спинномозговой жидкости рекомендуются сле дующие тесты: определение общего содержания белка, подсчет форменных элементов, глобулиновые реакции, реакция Вассермана с тремя разведениями спинномозго вой жидкости и коллоидная реакция с хлорным золотом (реакция Ланге), РИТ, РИФ 10 и РИФц (реакция имму нофлюоресценции с цельным неразведенным ликвором).

Определение общего белка. В патологически измененной спинномозговой жидкости больного сифилисом уве личивается количество белка. Определяется это в ступен чатых разведениях ликвора изотоническим раствором хлорида натрия от 1:5 до 1:80.

Количественное определение форменных элементов.

В нормальном ликворе, как правило, содержатся единич ные форменные элементы (лимфоциты). Увеличение числа форменных элементов и появление при плеоцитозе наряду с лимфоцитами плазматических клеток и моноци тов свидетельствует о патологическом изменении спин номозговой жидкости.

Глобулиновые реакции. Важное значение в диагностике патологии ликвора имеет определение в спинномозговой жидкости тяжелой фракции белков — глобулинов. К гло булиновым реакциям относятся реакции Нонне — Апель та и Панди, в основу которых положено свойство некоторых солей в определенных концентрациях осаждать избирательно глобулины из спинномозговой жидкости.

Реакция Ланге (реакция с коллоидным раствором хлорного золота). Принцип реакции основан на том, что коллоидные растворы золота, не изменяющиеся под влиянием ступенчатых разведений нормальной спинно мозговой жидкости, при тех же условиях в патологически измененной спинномозговой жидкости в присутствии электролитов (раствора хлорида натрия) претерпевают изменение степени дисперсности в зависимости от разве дения этой жидкости. Процесс выражается изменением цвета коллоидного раствора при выпадении осадка. Реак ция Ланге с коллоидным раствором хлорного золота име ет и диагностическое, и дифференциально диагностиче ское значение при раннем определении сифилитического поражения нервной системы.

Реакция Вассермана со спинномозговой жидкостью.

При сифилисе в спинномозговой жидкости могут содер жаться реагины и антитрепонемные комплементсвязываю щие антитела, которые определяются соответствующими антигенами. В спинномозговой жидкости отсутствует комплемент, поэтому реакцию Вассермана ставят с не инактивированным ликвором. Спинномозговая жид кость исследуется в реакции Вассермана неразведенной в объеме 0,5 мл и разведенной изотоническим раствором хлорида натрия 1:1 и 1:4.

Установлено, что резкоположительная и положительная реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью являются доказальством наличия у обследуемого сифи литической инфекции, но при этом необходимо иметь в виду, что отрицательные результаты реакции Вассермана не полностью исключают сифилис. В этих случаях необ ходима постановка других реакций.

РИФ и РИТ в спинномозговой жидкости. В настоящее время считается, что эти реакции со спинномозговой жидкостью являются абсолютно специфичными для сифилиса. РИФ в этих случаях используют в модификаци ях РИФ 10 и РИФц. Методики постановки и учет ре зультатов РИФ и РИТ в ликворе проводятся так же, как и при исследовании крови.

Диагноз активного нейросифилиса. Для оценки активности нейросифилиса можно использовать эмпириче

ские критерии, предложенные в 1949 г. Datter и Thomas:

1) нейросифилис может протекать асимптомно даже при наличии выраженной активности патологиче ского процесса в центральной нервной системе; от сутствие клинических симптомов не является пока зателем легкого течения нейросифилиса;

2) активность нейросифилиса не определяется поло жительными стандартными и серологическими ре акциями; более достоверным критерием является их сочетание с повышенным цитозом и общим ко личеством белка в спинномозговой жидкости;

3) при излечении нейросифилиса цитоз в спинномоз говой жидкости становится нормальным через 3–4 мес после окончания терапии, тогда как количест венные стандартные серологические реакции и об щий белок приходят в норму значительно позднее;

4) у больных активным нейросифилисом после лече ния пенициллином может наблюдаться тенденция к нормализации спинномозговой жидкости, что не исключает возможности рецидива болезни. Реци дивы нейросифилиса, однако, редко возникают раньше, чем через 1 год после окончания терапии. Если в спинномозговой жидкости нормализации цитоза, общего количества белка и стандартных се рологических реакций не происходит через 6 мес после окончания специфической терапии, больно му показано повторное лечение даже при отсутст вии клинических симптомов нейросифилиса.

Кроме указанных выше критериев в США для выявле ния активного нейросифилиса используют исследование реакции IgM SPHA, РИФ Абс. и РПГА. Если первая ре акция положительна, то у больного имеется активный нейросифилис. Две последние реакции позволяют ис ключить сифилитическую инфекцию центральной нерв ной системы.

По материалам xn--80ahc0abogjs.com

Обычно РВ ставится с двумя или тремя антигенами. Наиболее часто применяется отличающийся высокой чувствительностью кардиолипиновый антиген (экстракт из сердца быка, обогащенный холестерином и лецитином) и трепонемный антиген (обработанная ультразвуком взвесь анатогенных культуральных бледных трепонем). Совместно с реагинами сыворотки крови больного эти антигены образуют иммунный комплекс, способный адсорбировать и связывать комплемент. Для визуального определения образованного комплекса (реагины + антиген + комплемент) в качестве индикатора применяется гемолитическая система (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой). Если комплемент связан в 1 фазе реакции (реагины + антиген + комплемент), гемолиз не наступает — эритроциты выпадают в легко заметный осадок (РВ положительная). Если в 1 фазе комплемент не связан вследствие отсутствия в испытуемой сыворотке реагинов, он будет использован гемолитической системой и произойдет гемолиз (РВ отрицательная). Степень выраженности гемолиза при постановке РВ оценивается плюсами: полное отсутствие гемолиза ++++ или 4+ (РВ резкоположительная); едва начавшийся гемолиз +++ или 3+ (РВ положительная); значительный гемолиз ++ или 2+ (РВ слабоположительная); непонятная картина гемолиза ± (РВ сомнительная); полный гемолиз — (реакция Вассермана отрицательная).

Помимо качественной оценки РВ имеется количественная постановка с различными разведениями сыворотки (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный (4+) результат. Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых клинических форм сифилитической инфекции, а также при проведении контроля за эффективностью лечения. В настоящее время реакция Вассермана ставится с двумя антигенами (кардиолипиновый и трепонемный озвученный штамм Рейтера). Как правило, РВ становится положительной на 5-6 неделе после заражения у 25-60% больных, на 7-8 неделе — у 75-96%, на 9-19 неделе — у 100%, хотя в последние годы иногда раньше или позже. При этом, титр реагинов постепенно нарастает и достигает максимальной величины (1:160-1:320 и выше) в случае появления генерализованных высыпаний (сифилис вторичный свежий). При позитивации РВ выставляется диагноз первичного серопозитивного сифилиса.
При вторичном свежем и вторичном рецидивном сифилисе РВ положительная у 100% больных, но у истощенных больных с ослабленным иммунитетом может наблюдаться отрицательный результат. Впоследствии титр реагинов постепенно понижается и при вторичном рецидивном сифилисе обычно не превышает 1:80-1:120.
При третичном сифилисе РВ положительная у 65-70% больных и обычно наблюдается низкий титр реагинов (1:20-1:40). При поздних формах сифилиса (сифилис внутренних органов, нервной системы) положительная РВ наблюдается в 50-80% случаев. Титр реагинов колеблется от 1:5 до 1:320.
При скрытом сифилисе положительная РВ отмечается у 100% больных. Титр реагинов от 1:80 до 1:640, а при позднем скрытом сифилисе от 1:10 до 1:20. Быстрое снижение титра реагинов (вплоть до полной негативации) во время лечения свидетельствует об эффективности лечения.

Недостатки реакции Вассермана — недостаточная чувствительность (в начальной стадии первичного сифилиса отрицательная). Она негативная также у 1/3 больных, если они в прошлом лечились антибиотиками, у пациентов третичным активным сифилисом с поражениями кожи и слизистых, костно-суставного аппарата, внутренних органов, центральной нервной системы, при позднем врожденном сифилисе.
Недостаточная специфичность — реакция Вассермана может быть положительная у лиц, которые ранее не болели и не болеют сифилисом. В частности ложноположительные (неспецифические) результаты РВ отмечаются у больных, которые страдают системной красной волчанкой, лепрой, малярией, злокачественными новообразованиями, поражениями печени, обширными инфарктами миокарда и другими заболеваниями, а иногда у совершенно здоровых людей.
Кратковременная ложноположительная реакция Вассермана выявляется у некоторых женщин перед родами или после них, у лиц, злоупотребляющих наркотиками, после наркоза, приема алкоголя. Как правило, ложноположительная РВ выражена слабо, чаще с низким титром реагинов (1:5-1:20), положительная (3+) или слабо положительная (2+). При массовых серологических обследованиях частота ложноположительных результатов составляет 0,1-0,15%. Для преодоления недостаточной чувствительности, пользуются постановкой на холоде (реакция Колляра) и одновременно она ставится с другими серологическими реакциями.

Псевдорезистентность — после проведенного лечения несмотря на положительные серологические реакции бледная трепонема в организме отсутствует. Антигена в организме нет, но продолжается выработка антител, которые фиксируются при постановке серологических реакций.
Серологическая резистентность может развиваться вследствие:

  • неполноценного лечения без учета давности и стадии заболевания;
  • недостаточной дозы и в частности из-за неучета массы тела пациентов;
  • нарушения интервала между введением препаратов;
  • сохранения в организме бледных трепонем несмотря на проведенное полноценное специфическое лечение, из-за их стойкости к пенициллину и другим химиопрепаратам в случае наличия скрытых, осумкованных очагов поражения во внутренних органах, нервной системе, лимфатических узлах, которые малодоступны для антибактериальных препаратов (нередко бледные трепонемы обнаруживаются в тканях рубца через много лет после окончания терапии, в лимфатических узлах иногда удается обнаружить бледные трепонемы через 3-5 лет после противосифилитической терапии);
  • снижения защитных сил при различных заболеваниях и интоксикациях (эндокринопатии, алкоголизм, наркомания и др.);
  • общего истощения (приемом пищи бедной витаминами, белками, жирами).

Кроме этого, нередко выявляется ложная позитивация серологических реакций, не связанная с наличие у больных сифилиса и вызванная:

  • сопутствующими неспецифическими заболеваниями внутренних органов, нарушениями сердечнососудистой системы, ревматизмом, дисфункциями эндокринной и нервной систем, тяжелыми хроническими дерматозами, злокачественными новообразованиями;
  • поражениями нервной системы (тяжелые травмы, сотрясение головного мозга, психические травмы);
  • беременностью; хроническими интоксикациями алкоголем, никотином наркотиками; инфекционными болезнями (малярия, туберкулез, вирусный гепатит, дизентерия, сыпной, брюшной и возвратный тифы).

Указанные факторы могут оказывать влияние на иммунологическую реактивность организма как в период активного развития сифилитических проявлений, так и во время их регресса.

По материалам vse-zabolevaniya.ru

Несмотря на многочисленные особенности микробиологических характеристик бледной трепонемы и её взаимодействия с организмом человека, лабораторная диагностика сифилиса на этапе современной венерологии позволяет в полной мере определить период сифилиса, давность заражения и успешность проводимого лечения.

Для идентификации инфекции используют методы серологии, базирующиеся на исследовании крови, и бактериоскопические, позволяющие выявить бледную трепонему в пораженных тканях.

Диагностика сифилиса методами серологии позволяет обнаружить реакцию иммунитета человека в ответ на внедрение бактерии, тем самым, наличие антител будет говорить о заражении.

Трепонемы характеризуются сложным антигенным составом. В клеточной стенке бактерии расположены два липидных (липоидных) компонента, а также белковый и углеводный антигены. Эти антигены вызывают выработку различных классов антител в различные стадии сифилиса.

  1. Протеиновые антигены бледных трепонем считаются общими как для патогенной бактерии, так и для непатогенного их вида. Антитела IgM к ним вырабатываются довольно быстро: их можно обнаружить в сыворотке в течение первой недели от факта появления твёрдого шанкра.
  2. Полисахаридный антиген вызывает слабую продукцию антител, поэтому в серологической диагностике они малоинформативны.
  3. Липидные антигены являются объектом первоочередной скрининговой идентификации бледных трепонем. Антитела, вырабатывающиеся в ответ на липидный антиген называют реагинами или неспецифическими иммуноглобулинами.

С помощью серологических реакций в сыворотке крови обнаруживают антитела к различным антигенам.

Серологические тесты в диагностике сифилиса в особенности актуальны при идентификации скрытого (латентного) характера заболевания, его поздней стадии, также применяются для оценки успеха лечения больных.

В современной венерологии используются различные реакции: трепонемные и нетрепонемные тесты.

К нетрепонемным относят липидные реакции (реакция Вассермана, VDRL, RPR). Лабораторная диагностика сифилиса такими способами носит неспецифичный характер и используется для стартовой «отборочной» идентификации.

К трепонемным способам относят РИФ, РПГА, реакцию иммобилизации (РИБТ), ИФА. Тесты базируются на обнаружении специфичных антител в комплексе или отдельно (IgM и IgG).

Стандартными серологическими реакциями при идентификации трепонемы являются реакция Вассермана и её усовершенствованный вариант RPR, а также микропреципитация на стекле.

Реакции позволяют идентифицировать микроорганизмы по их липидному антигену. К ним относят:

  1. РСК – реакция связывания комплемента (реакция Вассермана).

В ответ на присутствие липидного антигена трепонемы в организме человека вырабатываются соответствующие антитела, которые связываются с антигеном и образуют в сыворотке крови иммунный комплекс. Через определённый фрагмент антитела с ним связывается один из факторов иммунной защиты – комплемент, т.е. происходит связывание иммунного комплекса с комплементом. Соответственно, если в организме бледных трепонем нет, то комплемент останется свободным.

Реакция Вассермана определяет наличие неспецифичных антител к микроорганизму. Для этого используются кардиолипиновый антиген животного или специально обработанный трепонемный антиген.

Для реакции применяется сыворотка крови животных, являющаяся источником комплемента. Для идентификации результата анализ дополняется индикаторами.

Серологическую диагностику сифилиса этим способом проводят в качественном и количественном вариантах:

  • Качественное исследование представляет собой определение наличия связи антител человека с липидным антигеном и комплементом. Положительный результат реакции Вассермана говорит о возможном заболевании. Результаты могут быть резкоположительными (++++), положительными (+++), слабоположительными (++), отрицательными.

Положительный результат не исключен после истечения 2-4 недель от факта появления шанкра.

  • Если результат положительный, то применяется количественный вариант исследования, а именно разведение сыворотки крови. Количественное определение антител также применяется для оценки успешности лечения больных. Если титр антител быстро снижается до негативных результатов, то это свидетельствует об успешности лечения. Самый значительный титр антител 1:160-1:320 наблюдается на вторичной стадии, а затем снижается до 1:80-1:120 в рецидивном вторичном периоде.
  1. Осадочные тесты (реакция преципитации).

Реакции базируются на осаждении иммунных комплексов «антиген-антитело» в виде помутнения. В ходе анализа к сыворотке пациента добавляют антиген микроорганизма и, если в ней есть антитела к Treponema pallidum, то анализ будет положительный.

  1. Микрореакции преципитации на стекле считаются методами экспресс-диагностики сифилиса.

Для такой диагностики сифилиса используются тесты VDRL, RPR, определяющие антитела. Эти реакции используются для выполнения массового скрининга.

  • VDRL — самая распространённая реакция экспресс-диагностики для выделения антител к липидному антигену. Анализ оценивают качественно (4+, 3+, 2+, отрицательно), а также количественно – в разведениях сыворотки с подсчётом титра реагинов.

Положительный результат фиксируется спустя 1-3 недели после возникновения первых симптомов и всегда позитивен во вторичном периоде. Сыворотку разводят в различных соотношениях и, если результат позитивен при разведении 1:8, то для подсчёта количества (титра) антител ставят тесты с серийными разведениями сыворотки. Выполняют анализ два раза с интервалом в 2 недели. Если титр антител увеличился в 4 раза, то результат интерпретируется как положительный.

  • RPR представляет собой современный усовершенствованный аналог реакции Вассермана. Данное экспресс-исследование подразумевает выявление неспецифичных антител против липидного антигена трепонемы.

С помощью нетрепонемных серологических реакций проводят скрининговое исследование для обнаружения инфекции:

  1. При беременности (анализ сдают 3 раза), донорстве, среди медицинских работников, работников сферы питания, учреждений образования, перед оперативными вмешательствами и при госпитализации.
  2. При подозрении на заболевание, если у пациента присутствуют подозрительные язвы, ИППП, при половых отношениях с больным сифилисом.
  3. При подозрении на врождённый сифилис.
  4. После завершения курса лечения больных от данной инфекции.

При врождённом сифилисе отмечают постепенное увеличение титра антител, а снижение их говорит о наличии материнских антител у ребёнка и отсутствии у него заболевания.

Если нетрепонемные тесты имеют отрицательные результаты, то данный вариант интерпретируют следующим образом:

  1. Заболевание отсутствует.
  2. Ранняя стадия болезни. Если от факта инфицирования бледной трепонемой прошло менее 2-5 недель, то выработанных антител в сыворотке против липидного антигена недостаточно для идентификации.
  3. Третичный период инфекции: антитела на липидный антиген продуцируются в небольшом количестве.
  4. В очень редких случаях регистрируются ложноотрицательные результаты, когда антитела в сыворотке содержатся в значительном количестве.

Для принятия окончательного решения выполняют трепонемные тесты.

В норме серологические тесты имеют негативные результаты.

Серологическая диагностика сифилиса в различные периоды инфекции имеет неодинаковую чувствительность:

  • В первичном периоде — 70-80%;
  • Во вторичном — 100%;
  • В третичном — 30-50%.

После завершения курса лечения все нетрепонемные методы (реакция Вассермана, VDRL, RPR) у больных должны быть негативные. В 90% анализы отрицательные.

Подготовка к сдаче крови:

  • Накануне исследования (за 12 часов) из питания следует исключить жирные продукты, алкоголь;
  • Последний приём пищи допускается за 8 часов до анализа.
  • Курение за 1 час до взятия крови исключается;
  • Сдают анализ строго натощак (можно выпить воду);
  • Непосредственно перед сдачей крови исключается физиотерапия, флюорография, рентгенография, УЗИ, стрессовые ситуации.

Диагностика сифилиса проводится путем исследования венозной крови, за исключением экспресс-метода (для анализа берут кровь из пальца).

Нетрепонемные тесты для обнаружения липидных антигенов иногда дают ложноположительные результаты. Липидный антиген по своей структуре очень похож на некоторые клеточные компоненты у человека. При различных состояниях, когда возможна выработка аутоантител к собственным липидным структурам, результаты могут стать ложноположительными.

  • Беременность;
  • Пожилой возраст;
  • Наркомания (внутривенное введение);
  • Хронические инфекционные заболевания (вирусные гепатиты, туберкулёз, ВИЧ/СПИД, лепра, малярия);
  • Подагра;
  • Аутоиммунные заболевания (системная красная волчанка, склеродермия, системный васкулит, рассеянный склероз, синдром Гийена-Баре, ревматоидный артрит, тромбоцитопеническая пурпура, аутоиммунная нейтропения, синдром Шегрена, аутоиммунные поражения внутренних органов (тиреоидит, гепатит, колит, гломерулонефрит), некоторые кожные заболевания (псориаз, витилиго), сахарный диабет 1 типа и др.
  • При заболеваниях, вызванных другими видами трепонем (фрамбезии).

Ложноположительная реакция Вассермана характеризуется низким количеством антител (1:5-1:20), либо слабоположительным результатом (2+).

Для того, чтобы результаты анализов были достоверными, их используют сочетанно и проводят в динамике. После получения ложноположительного результата выполняют трепонемные тесты.

При анализе ликвора ложноположительные результаты регистрируются очень редко.

Анализы включают реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), реакцию иммобилизации (РИБТ), реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) и иммуноферментный анализ (ИФА).

  1. РИФ становится позитивной раньше, чем реакция Вассермана. Это обусловлено более высокой специфичностью РИФ. В данном анализе также обнаруживают антитела в организме, вызванные бледной трепонемой, но антигеном выступают тканевые трепонемы, а не только их изолированный антиген. Препарат из бактерий располагают на предметных стёклах. Если в сыворотке крови есть антитела — они связываются с бактериями на стекле. Далее материал обрабатывают флуоресцирующей сывороткой и определяют свечение. По степени флуоресценции проводят оценку: если нет антител, то микроорганизмы не видны, а при присутствии, бактерии светятся (от 1+ до 4+).
  • Ранняя стадия – 80%;
  • Вторичный – 100%;
  • Третичный и скрытый период – 95-100%.
  1. РИБТ является дорогостоящим, но более специфичным анализом, чем РИФ. Реакция даёт положительный результат в 100% исследований. Реакция иммобилизации подразумевает поиск иммобилизинов – антител, которые обездвиживают бактерии. Живые бледные трепонемы выступают в качестве антигена при проведении исследования.

Для оценки подсчитывают количество бактерий, утративших способность двигаться:

  • РИБТ позитивна при утрате подвижности 51-100% бактерий;
  • Слабоположительный результат – 31-50%;
  • Сомнительные результаты – 21-30%;
  • Отрицательные – 0-20%.

Позитивные результаты РИБТ регистрируются позднее, чем при РИФ и реакции Вассермана. Исходя из этого, для особо заразительных периодов инфекции (первичный и вторичный), тест не выполняют.

Диагностика сифилиса с помощью РИБТ применяется в следующих ситуациях:

  • Подозрение на врождённый сифилис;
  • При третичной стадии;
  • При поражении внутренних органов;
  • Подозрение на нейросифилис;

Следует иметь ввиду, что диагностику сифилиса методом РИБТ проводят через 2-4 недели после лечения антибиотиками (в случае их применения), так как содержащиеся в крови антибактериальные вещества губительно повлияют на препарат и обеспечат ложноотрицательтный результат.

  1. РПГА определяет наличие специфичных антител IgG, IgM в комплексе. Для этого используются специальные эритроциты животных, на поверхности которых адсорбированы антигены трепонемы. К таким эритроцитам добавляют сыворотку больного. Если в ней содержатся антитрепонемные антитела, то результат будет положительный.

Диагностика сифилиса таким методом высокоспецифична (100%), но в первичный период обладает не весьма высокой чувствительностью (86%).

  1. ИФА позволяет определить количество антител различных классов (IgG, IgM), что позволяет оценить давность заболевания.
  • IgM – показатели свежего инфекционного процесса либо вторичного рецидивного периода. IgM начинают вырабатываться в организме через 4 недели от момента попадания трепонемы, а исчезают через 18 месяцев. Если первичный период начал поддаваться лечению сразу, то IgM элиминируются через 3-6 месяцев.
  • IgG свидетельствуют о давнем заражении, а также длительно сохраняются после лечения больных сифилисом.

По материалам prourologia.ru

Анализ на сифилис является одним из самых распространенных среди лабораторных исследований. Широко используются анализы на сифилис при проведении профилактических обследований. При помощи микроскопии выявляется возбудитель сифилиса — бледная трепонема. При помощи серологических реакций подтверждается диагноз сифилиса, устанавливается диагноз скрытого сифилиса, проводится контроль эффективности лечения, определяется излеченность больных.

Диагноз сифилиса устанавливается на основании клинических данных, обнаружении возбудителей сифилиса в образцах материала и подтверждении диагноза серологическими методами исследования. Проявления сифилиса многочисленны и многообразны, ввиду чего болезнь выявляется врачами разных специальностей. Дифференциальная диагностика первичного сифилиса проводится с целым рядом заболеваний.

Рис. 1. На фото первичное проявление сифилиса — твердый шанкр.

При заражении сифилисом в организме больного образуются антитела. Серологическая диагностика помогает врачу изучать динамику образования антител в организме больного сифилисом в начальных стадиях заболевания, в период лечения и после его окончания, решить вопрос рецидив заболевания у больного или повторное заражение (реинфекция), поставить диагноз сифилиса при массовых медицинских условиях.

Первыми после заражения начинают вырабатываться антитела IgM. Они начинают выявляться при помощи серологических реакций уже со второй недели после заражения. На 6 — 9 неделях заболевания их количество становится максимальным. Если больной не лечился, то антитела исчезают через полгода. Антитела IgM исчезают через 1 — 2 мес. после лечения раннего сифилиса, через 3 — 6 мес. — после лечения позднего сифилиса. Если регистрируется их рост, то это служит признаком рецидива сифилиса или говорит о повторном заражении. Молекулы IgM крупные и через плаценту к плоду не переходят.

Антитела иммуноглобулины IgG появляются в конце первого месяца (на 4-й неделе) от момента заражения. Их титр выше, чем титр IgM. IgG сохраняются после излечения достаточно длительное время.

Существует множество серологических реакций. Это объясняется антигенной множественностью бледных трепонем. В сыворотке крови больного человека на разных стадиях сифилиса кроме специфических образуются те или иные неспецифические антитела — агглютинины, комплементсвязывающие, иммобилизины, антитела, вызывающие иммунную флюоресценцию, преципитины и др. Серологические реакции по выявлению неспецифических антител обладают относительной специфичностью поэтому, чтобы избежать диагностических ошибок, следует пользоваться не одним, а комплексом серологических реакций (КСР).

Отличительной особенностью нетрепонемных тестов является получение ложноположительных реакций. Антитела-реагины, которые вырабатываются в крови человека против кардиолипинового антигена, регистрируются не только при сифилисе, но и при других заболеваниях: коллагенозах, гепатитах, заболеваниях почек, тиреотоксикозе, онкозаболеваниях, при инфекционных заболеваниях (лепра, туберкулез, бруцеллез, малярия, сыпной тиф, скарлатина), при беременности и месячных циклах, при приеме жирной пищи и алкоголя. Отмечено, что с возрастом количество ложноположительных реакций возрастает.

Рис. 2. На фото первичный сифилис у женщин.

Серологические тесты на сифилис подразделяются на трепонемные и нетрепонемные.

В качестве антигена в этой группе тестов используется кардиолипиновый антиген. Липидные антигены возбудителей сифилиса самые многочисленные. Они составляют 1/3 сухой массы клетки. С помощью нетрепонемных тестов выявляются антитела-реагины, которые вырабатываются против кардиолипинового антигена. В эту группу входит реакция связывания комплемента (РСКкард), реакция микропреципитации (РМП), реакция быстрого определения реагинов плазмы (RPR) и др. С помощью нетрепонемных тестов проводится первичный скрининг на сифилис (обследование групп населения), а возможность получения результатов в количественном варианте позволяет использовать эти тесты с целью контроля эффективности лечения. Положительные результаты нетрепонемных тестов должны подтверждаться трепонемными тестами. Отличительной особенностью нетрепонемных тестов является получение ложноположительных реакций.

В трепонемных тестах используются антигены трепонемного происхождения, выделенные из культуры бледных трепонем. С их помощью подтверждаются положительные результаты нетрепонемных тестов. В группу входят: РСКтреп — реакция связывания комплемента, РИФ — реакция иммунофлюоресценции и ее модификации, РИТ, РИБТ — реакция иммобилизации бледных трепонем, РПГА — реакция пассивной гемагглютинации, ИФА — иммуноферментный анализ.

Антигены для данной группы тестов получают генно-инженерным путем и используют в реакциях — РПГА и ИФА, в анализах иммуноблоттинга (ИБ) и иммунохроматографическом анализе.

Рис. 3. Для диагностики сифилиса используется комплекс серологических тестов.

Для выявления сифилиса используются нетрепонемные тесты или комплекс серологических реакций (КСР). Серологическая диагностика применятся с 5-й недели от момента заражения или с 2-3 недели после появления твердого шанкра. Антитела выявляются практически у всех больных со свежим первичным, вторичным и рецидивным сифилисом. Серологические реакции положительные у 70 — 80% больных с третичным активным сифилисом, в 50 — 60% случаев у больных третичным скрытым сифилисом.

Серологические реакции с применением нетрепонемных тестов могут давать ложноположительные результаты.

Рис. 4. Забор крови для проведения анализа на сифилис.

Реакция Вассермана (RW, РВ), изобретенная А. Вассерманом более 100 лет назад, сегодня претерпела множество изменений, однако, как дань традиции, сохранила свое название по настоящее время. Реакция связывания комплемента с применением кардиолипинового антигена предназначена не только для выявления антител, но и выполняется в количественном варианте — с разными разведениями сыворотки, что позволяет использовать ее для контроля эффективности лечения. Низкая чувствительность и специфичность, получение ложноположительных результатов — отрицательные стороны данного вида исследования.

Суть реакции Вассермана заключается в следующем: антигены, которые применяются при постановке реакции Вассермана, в случае наличия антител к возбудителям сифилиса в крови человека посредством комплимента связываются с ними и выпадают в осадок. Интенсивность реакции обозначают знаком (+). Реакция может быть отрицательной (-) — отсутствие осадка, сомнительной (небольшой осадок или +), слабоположительной (++), положительной (+++) и резко положительной (++++).

Более чувствительной является видоизмененная реакция Вассермана — реакция Колмера. С ее помощью выявляются антитела в сыворотках, где реакция Вассермана дала отрицательный результат.

При резко положительных реакциях проводится количественное определение реагинов, для чего используется сыворотка в разведениях от 1:10 до 1: 320, что позволяет использовать данный вид исследования для контроля эффективности лечения. Например, снижение титра антител и последующая их серонегативация (получение отрицательных результатов), говорит об успешном излечении заболевания.

Рис. 5. Анализ крови на сифилис — реакция Вассермана.

Микрореакция преципитации применяется для массовых обследований отдельных групп населения, диагностики сифилиса и контроля над эффективностью лечения. Для проведения данного вида исследования необходимо небольшого количества исследуемого материала. В основе микрореакции преципитации лежит иммунологическая реакция антиген-антитело. В случае наличия антител в сыворотке крови обследуемого комплекс антиген-антитело выпадает в осадок с образованием хлопьев. Реакция проводится в лунках специальной стеклянной пластины. Оценивается по интенсивности выпавшего осадка и величине хлопьев в (+) как реакция Вассермана. При обследовании беременных, доноров и для контроля эффективности лечения не применяется. VDRL и RPR являются разновидностями микрореакций.

Рис. 6. Вид реакции преципитации в капле на стекле.

Рис. 7. Анализ крови на сифилис — реакция микропреципитации.

Рис. 8. Набор для проведения реакции быстрого определения реагинов плазмы (Тест на сифилис RPR).

Все положительные тесты, полученные при проведении неспецифических серологических реакций, требуют подтверждения специфическими реакциями — трепонемными тестами.

При проведении трепонемных тестов используются антигены трепонемного происхождения. Их отрицательной стороной является невозможность использования для контроля эффективности проводимого лечения, получение положительных результатов при спирохетозах и невенерических трепонематозах и получение ложноположительных результатов при онкологических заболеваниях, лепре, некоторой эндокринной патологии. Такие тесты, как РПГА, ИФА и РИФ остаются положительными многие годы после излечения сифилиса, а в некоторых случаях и пожизненно.

РИБТ и РИФ являются более специфическими из всех серологических реакций, применяемых для диагностики сифилиса. Они позволяют различать ложноположительные реакции, выявлять поздние формы сифилиса, протекающие с отрицательными реакциями. При помощи РИБТ распознаются ложноположительные реакции у беременных, когда необходимо решить вопрос об инфицированности ребенка.

Суть реакции заключается в том, что антитела, находящиеся в сыворотке крови больного, обездвиживают бледные трепонемы. Отрицательной считается реакция при иммобилизации до 20% возбудителей, слабоположительная — 21 — 50%, положительная — 50 — 100%. РИБТ иногда дает ложноположительные результаты. Тест сложный и трудоемкий, однако, является незаменимым при проведении дифференциальной диагностики скрытых форм заболевания и ложноположительных результатов серологических реакций, в том числе у беременных. РИБТ дает 100% положительный результат при вторичном, раннем и позднем сифилисе, в 94 — 100% случаев — при других формах сифилиса.

Суть реакции заключается в том, что бледные трепонемы (антигены), соединенные с антителами, меченными флюорохромами, издают в люминесцентном микроскопе желто-зеленое свечение. Результат оценивается знаком (+). С помощью РИФ выявляются иммуноглобулины класса А. Реакция иммунофлюоресценции становится положительной раньше, чем реакция Вассермана. Она всегда положительная при вторичном и латентном сифилисе, в 95 — 100% случаев положительная при третичном и врожденном сифилисе. Техника проведения данного вида исследования проще, чем у РИБТ, но заменить РИФ на РИБТ невозможно, так данная реакция уступает РИБТ по специфичности. РИФ-10 (модификация РИФ) более чувствительна, РИФ-200 и РИФ-абс более специфичны.

Рис. 9. Анализ крови на сифилис — реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Суть реакции заключается в том, что сенсибилизированные сывороткой больного бледные трепонемы в присутствии комплемента прилипают к поверхности эритроцитов. Полученные комплексы при цетрофугировании выпадают в осадок. Чувствительность данного теста и специфичность близки к РИФ и РИБТ.

С помощью ИФА определяются иммуноглобулины класса М и G. Методика IgM – ИФА может быть использована в качестве скринингового и подтверждающего теста. Чувствительность ИФА и его специфичность аналогичны РИФ. При сифилисе ИФА дает положительные результаты с третьего месяца инфицирования и довольно долго (иногда всю жизнь) остается положительным.

Рис. 10. Иммуноферментный анализатор.

РПГА основана на способности эритроцитов, на которых адсорбированы антигены бледной трепонемы, в присутствии сыворотки больного склеиваться (гемагглютинация). РПГА применяется для диагностики всех форм сифилиса, в том числе скрытого. При применении высокого качества антигена данный вид серологической реакции превышает все остальные тесты по специфичности и чувствительности.

Рис. 11. РПГА применяется для диагностики всех форм сифилиса.

Рис. 12. Анализ на сифилис — реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (схема).

Рис. 13. Вид перевернутого зонтика, занимающего все дно пробирки, свидетельствует о положительной реакции. В случае, когда эритроциты оседают столбиком («пуговка») в центре дна пробирки говорят об отрицательной реакции.

Рис. 14. Тест РПГА в лабораторных условиях.

Наряду с серологической диагностикой методика обнаружения бледных трепонем (микробиологическая диагностика) играет важную роль, особенно в период серонегативного сифилиса, когда еще в крови отсутствуют антитела, но уже есть первые проявления свежего первичного сифилиса (твердый шанкр).

Биологическим материалом для исследования служит отделяемое с поверхности твердых язв (шанкров), содержимое пустулезных сифилидов, мокнущих и эрозивных папул, пунктаты инфицированных лимфатических узлов, ликвор и амниотическая жидкость, для проведения ПЦР — кровь.

Наилучшей методикой обнаружения возбудителей сифилиса является исследование биологического материала в темном поле микроскопа. Данная методика позволяет увидеть бледные трепонемы в живом состоянии изучить ее особенности строения и движения, отличить патогенные возбудители от сапрофитов.

Рис. 15. Анализ на сифилис — темнопольная микроскопия.

Рис. 16. При изучении сухих мазков используется окраска по Романовскому-Гимзе. Бледные трепонемы окрашиваются при этом в розовый цвет, все остальные виды спирохет — в фиолетовый.

Обнаружение бледных трепонем при микроскопии в темном поле — абсолютный критерий окончательной диагностики сифилиса.

Рис. 17. Для выявления бактерий применяется реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — трепонемный тест. Специфический комплекс антиген- антитело при соединении со специфической сывороткой, меченной флюорохромом, в свете люминесцентного микроскопа дает свечение бактерий зеленоватым цветом.

Рис. 18. Возбудители сифилиса хорошо просматриваются в мазках, приготовленных по методике Левадити (импрегнация серебром). Бледные трепонемы темного цвета на фоне желтой окраски клеток инфицированных тканей.

Рис. 19. Возбудитель сифилиса при многократном увеличении.

Рис. 20. На фото колонии бледных трепонем. Получить культуру бактерий тяжело. Они практически не растут на искусственных питательных средах. На средах, содержащих лошадиную и кроличью сыворотки, колонии появляются на 3 — 9 сутки.

Эффективным и перспективным сегодня является методика проведения полимеразной цепной реакции. ПЦР на сифилис позволяет получить результат в течение нескольких часов, а в собранном для диагностики материале может присутствовать хотя бы несколько возбудителей заболевания.

Рис. 21. ПЦР на сифилис позволяет обнаружить ДНК или ее фрагменты бледных трепонем.

Чувствительность данного метода исследования зависит от наличия в биологическом материале бледных трепонем и достигает 98,6%. Специфичность данного теста во многом зависит от правильного выбора мишени для амплификации при проведении диагностики и достигает 100%.

Вместе с тем, в связи с недостаточно изученной сравнительной характеристики чувствительности и специфичности прямых методов диагностики сифилиса и ПЦР, данный метод обследования в РФ для диагностики заболевания пока не разрешен.

ПЦР на сифилис разрешено проводить лишь в некоторых случаях, как дополнительный метод диагностики врожденного сифилиса, нейросифилиса, при затруднениях проведения диагностики сифилиса с использованием серологических методов исследования у ВИЧ-больных.

Рис. 22. Выявление ДНК бледной трепонемы с применением ПЦР говорит либо о наличии жизнеспособных бактерий, либо об остатках погибших, но содержащих способных к образованию дополнительных копий отдельных участков хромосомной ДНК.

По материалам microbak.ru


Adblock
detector